外泌體因其與親代細(xì)胞的高度同源性而在臨床診斷中發(fā)揮著非常重要的作用。然而，傳統(tǒng)的外泌體檢測(cè)方法仍面臨設(shè)備昂貴、靈敏度低、程序復(fù)雜等挑戰(zhàn)。場(chǎng)效應(yīng)晶體管（FET）不僅是現(xiàn)代微電子工業(yè)中最重要的電子元件，而且由于其具有快速響應(yīng)、高靈敏度和無(wú)標(biāo)記檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在生物分子檢測(cè)方面顯示出巨大潛力。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，中國(guó)科學(xué)院微電子研究所（Institute of Microelectronics，Chinese Academy of Sciences）的研究人員開(kāi)發(fā)了一種用特定抗體進(jìn)行化學(xué)修飾的硅（Si）納米線場(chǎng)效應(yīng)晶體管（Si-NW Bio-FET）器件，用于外泌體的電學(xué)和無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。相關(guān)研究以“Si nanowire Bio-FET for electrical and label-free detection of cancer cell-derived exosomes”為題發(fā)表在Microsystems & Nanoengineering期刊上。

首先，研究人員對(duì)硅納米線Bio-FET進(jìn)行了制造和表征，如圖1a和圖2所示，該器件由硅納米線FET器件和PDMS微流體層構(gòu)成，尺寸為15mm × 26mm，具有用于通過(guò)外部注射泵加載外泌體樣品的入口和出口（圖2a）。通過(guò)SEM成像技術(shù)可觀察到均勻的硅納米線（Si-NW，圖2b），其長(zhǎng)10μm、寬45nm、高29nm，具有矩形橫截面。外泌體特異性抗體共價(jià)固定在硅納米線的表面，作為外泌體靈敏檢測(cè)的識(shí)別元件（圖1b）。此外，抗體與外泌體之間的親和相互作用可能會(huì)引起硅納米線Bio-FET器件的電響應(yīng)（即漏極電流變化和閾值電壓變化），從而實(shí)現(xiàn)外泌體的電學(xué)和無(wú)標(biāo)記檢測(cè)（圖1c）。

圖1 a）硅納米線Bio-FET示意圖；b）硅納米線Bio-FET橫截面示意圖；c）信號(hào)變化示意圖；d）硅納米線Bio-FET的簡(jiǎn)化制造工藝示意圖：（I）具有p型（100）晶面的SOI晶圓；（II）頂部硅層的減薄；（III）SiO2/α-Si/Si3N4層的沉積；（IV）α-Si的圖案；（V）Si3N4的沉積；（VI）Si3N4硬掩模的形成；（VII）去除α-Si；（VIII）SiO2和頂部硅反應(yīng)離子刻蝕（RIE）；（IX）硅納米線的形成。

圖2 a）硅納米線Bio-FET圖像；b）硅納米線區(qū)域的SEM圖像（比例尺為5μm）：插圖I為硅納米線橫截面；插圖II為硅納米線俯視圖。

接著，研究人員使用硅納米線Bio-FET對(duì)外泌體進(jìn)行電學(xué)和無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。CD63蛋白作為跨膜-4超家族（transmembrane-4 superfamily）的成員之一，已被發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)外泌體亞群中含量豐富。此外，CD63蛋白在A549外泌體表面高度表達(dá)，因此，研究人員選擇CD63抗體作為捕獲抗體。

為了研究Bio-FET對(duì)外泌體的反應(yīng)，利用A549細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液（其中存在來(lái)自A549細(xì)胞系的外泌體顆粒）作為分析物，并在經(jīng)過(guò)CD63抗體修飾后，使用Bio-FET檢測(cè)A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外泌體。

圖3a顯示了分別用PBS以及10倍和100倍稀釋的A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液測(cè)量的Bio-FET的漏極電流-柵極電壓（ID-VG）轉(zhuǎn)移曲線。ID-VG曲線顯示，A549上清液稀釋液中的ID值低于空白PBS溶液。此外，ID隨著稀釋因子的降低（溶液中外泌體濃度的增加）而降低。PBS、100倍稀釋的A549上清液和10倍稀釋的A549上清液的閾值電壓（Vth，對(duì)應(yīng)ID為2.19?nA的柵極電壓）分別為-1.35?V、-2.16?V和-3.03?V。隨著外泌體濃度的增加，Vth向左移動(dòng)。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bio-FET可成功測(cè)量A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外泌體濃度，且ID-VG曲線的變化與外泌體濃度有關(guān)。

圖3 a）用PBS和不同稀釋度的A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液測(cè)量的硅納米線Bio-FET的ID-VG曲線；b）由CD63抗體修飾的硅納米線捕獲的外泌體的SEM圖像（比例尺：400nm）；c）DiO染色后CD63抗體修飾的硅納米線Bio-FET的熒光圖像；d）無(wú)CD63抗體修飾的硅納米線的SEM圖像（比例尺：400nm）；e）DiO染色后未經(jīng)抗體修飾的硅納米線Bio-FET的熒光圖像（比例尺：500μm）。

為了驗(yàn)證外泌體是否可以被捕獲在硅納米線Bio-FET表面，研究人員使用SEM進(jìn)行觀察。圖3b的SEM圖像中的紅色虛線圓圈內(nèi)區(qū)域清楚地顯示了外泌體在硅納米線上被捕獲。相比之下，沒(méi)有CD63抗體修飾的硅納米線上幾乎沒(méi)有外泌體顆粒（圖3d），從而證明了外泌體被CD63抗體成功捕獲在硅納米線上。為了進(jìn)一步驗(yàn)證硅納米線上外泌體的存在，研究人員將CD63抗體捕獲的外泌體用DiO染料染色，該染料可以染色外泌體的脂質(zhì)雙層膜。通道內(nèi)的熒光圖像如圖3c、3e所示。與未經(jīng)抗體修飾的硅納米線Bio-FET相比，CD63抗體修飾的硅納米線Bio-FET內(nèi)部顯示出熒光強(qiáng)度顯著增加，進(jìn)一步證明了外泌體被抗體成功捕獲。

為了進(jìn)一步測(cè)試硅納米線Bio-FET對(duì)外泌體檢測(cè)的敏感性，研究人員通過(guò)超速離心（UC）純化了A549衍生的外泌體樣品。首先將外泌體濃度由1.84?×?10?個(gè)顆粒/mL稀釋至1.84?×?10?顆粒/mL~1.84?×?10?顆粒/mL區(qū)間的不同濃度，并將這些樣品應(yīng)用于CD63抗體修飾的硅納米線Bio-FET，隨后記錄硅納米線Bio-FET的ID-VG曲線。如圖4a所示，漏極電流隨著檢測(cè)過(guò)程中外泌體濃度的增加而降低。此外，隨著外泌體濃度的增加，Vth向左移動(dòng)，且未結(jié)合的抗體位點(diǎn)逐漸被填充，導(dǎo)致電流逐漸減小。圖4b顯示了外泌體濃度和電壓閾值之間的線性關(guān)系，獲得的校準(zhǔn)曲線顯示在4-log動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)可以進(jìn)行定量檢測(cè)，在3σ處的檢測(cè)限（LOD）為2159個(gè)顆粒/mL（約等于2個(gè)顆粒/μL），高于一些基于電化學(xué)和其他方法的檢測(cè)。通過(guò)設(shè)計(jì)微通道結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)分析物溶液與通道底部納米線之間的相互作用，可以進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。

圖4 a）硅納米線Bio-FET與不同濃度外泌體相互作用的轉(zhuǎn)移曲線；b）硅納米線Bio-FET在一系列外泌體濃度下的Vth。

最后，研究人員研究了硅納米線Bio-FET的實(shí)時(shí)檢測(cè)能力。將樣品注入微通道5分鐘后測(cè)量實(shí)時(shí)ID。VG和VD分別設(shè)置為-5V和-1.2?V。不同外泌體濃度的實(shí)時(shí)ID如圖5a所示。從圖中可以看出，隨著時(shí)間的增加，ID趨于保持不變，隨著濃度的增加，ID逐漸減小，而穩(wěn)態(tài)ID和外泌體濃度之間呈對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系（圖5b）。

對(duì)微流控通道內(nèi)外泌體濃度和漏極電流的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果如圖5c所示，外泌體濃度的增加導(dǎo)致漏極電流降低。此外，對(duì)微通道內(nèi)外泌體濃度降低的實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)新的外泌體溶液注入通道時(shí)，如果抗體結(jié)合位點(diǎn)未被占據(jù)，外泌體與抗體的結(jié)合會(huì)繼續(xù)，從而進(jìn)一步降低電流。因此，硅納米線Bio-FET具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微流體通道中分析物濃度變化的潛力。

圖5 a）不同濃度外泌體溶液的實(shí)時(shí)響應(yīng)；b）穩(wěn)態(tài)漏極電流與外泌體濃度之間的關(guān)系；c）微通道內(nèi)外泌體濃度變化時(shí)漏極電流的實(shí)時(shí)響應(yīng)。

總之，該研究開(kāi)發(fā)了一種高度靈敏的CD63抗體功能化硅納米線Bio-FET，用于外泌體的電學(xué)和無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。結(jié)果表明，硅納米線Bio-FET對(duì)A549外泌體的檢測(cè)限為2159個(gè)顆粒/mL，高于許多其他電化學(xué)方法。此外，硅納米線Bio-FET能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)外泌體的變化，其實(shí)時(shí)電流隨著外泌體濃度的增加而降低。從而為靈敏、無(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)的外泌體檢測(cè)提供了一種新的CMOS兼容策略，有望在未來(lái)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和臨床診斷。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41378-022-00387-x

審核編輯 ：李倩