增強(qiáng)子是基因組中一類非編碼調(diào)控元件，它能使細(xì)胞內(nèi)特定的基因得到明顯地上調(diào)。在基因調(diào)控的過程中，增強(qiáng)子在序列特異性轉(zhuǎn)錄因子的引導(dǎo)下，與相應(yīng)的啟動(dòng)子發(fā)生作用，以激活下游基因的表達(dá)。正常的增強(qiáng)子激活在維持哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因的發(fā)展方面起著重要的作用。然而，基因不可控的表達(dá)增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生一系列異常的行為，如腫瘤的發(fā)生和過度增殖。鑒定增強(qiáng)子的活性，特別是在活細(xì)胞中，將為解析癌癥中基因表達(dá)異常的機(jī)制提供重要線索。

近日，北京航空航天大學(xué)常凌乾課題組在ACS Sensors期刊上發(fā)表了一篇名為“Sensitive Interrogation of Enhancer Activity in Living Cells on a Nanoelectroporation-Probing Platform”的文章。該研究工作中發(fā)展了一種納米電穿孔探針平臺(tái)，通過采用納米電穿孔生物芯片，利用納米孔提供聚集的電場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的可逆穿孔，同時(shí)產(chǎn)生電泳力，將用于增強(qiáng)子活性檢測(cè)的探針高效地遞送至細(xì)胞核內(nèi)（圖1）。

圖1 納米電穿孔探針平臺(tái)用于活細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)子活性鑒定：（A）納米電穿孔探針平臺(tái)工作原理；（B）PH探針鑒定增強(qiáng)子活性并產(chǎn)生放大熒光信號(hào)的原理；（C）納米電穿孔生物芯片實(shí)物圖；（D）納米孔的電鏡掃描圖像；（E）細(xì)胞核靠近納米孔附近的膜內(nèi)外電勢(shì)差模擬結(jié)果。

由于增強(qiáng)子激活基因表達(dá)的方式取決于其與啟動(dòng)子的相互作用，鑒定增強(qiáng)子活性實(shí)際上意味著評(píng)估目標(biāo)增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間的相互作用。考慮到這種相互作用的獨(dú)特性，該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一組DNA探針，名為“PH探針”。PH探針由序列P1、P2、H1和H2組成。其中，P1與P2互補(bǔ)結(jié)合。H1和H2可自組裝為具有粘性末端的“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)。P1的3’端能夠特異性結(jié)合增強(qiáng)子序列。當(dāng)增強(qiáng)子與啟動(dòng)子相互作用，P1的5’端將與啟動(dòng)子序列結(jié)合，原本結(jié)合在P1上的P2被替換下來。替換下來的P2能夠與H1的粘性末端結(jié)合，并打開H1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而恢復(fù)熒光。隨后，H2的粘性末端將與H1結(jié)合，使結(jié)合在H1上的P2被替換下來。被替換下來的P2又能與新的H1結(jié)合，繼而開始新一輪的熒光信號(hào)恢復(fù)，最終使熒光信號(hào)產(chǎn)生百倍增強(qiáng)（圖2）。

圖2 PH探針的功能驗(yàn)證：（A）H1和H2探針對(duì)序列P2的識(shí)別能力；（B）PH探針在不同序列搭配下的熒光強(qiáng)度；（C）H1和H2探針檢測(cè)序列P2的反應(yīng)時(shí)間；（D）H1和H2探針檢測(cè)序列P2的熒光強(qiáng)度的校準(zhǔn)曲線，插圖顯示H1和H2檢測(cè)序列P2的檢測(cè)限為5 nM。

利用納米電穿孔生物芯片將PH探針高效且安全地遞送至活細(xì)胞內(nèi)，該平臺(tái)成功地在活細(xì)胞內(nèi)鑒定了CCAT1增強(qiáng)子活性。CCAT1是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，其在腫瘤中的異常高表達(dá)已被報(bào)道與增強(qiáng)子激活有關(guān)。該平臺(tái)將傳統(tǒng)增強(qiáng)子活性檢測(cè)方法的時(shí)間從幾天縮短到不到一個(gè)小時(shí)，同時(shí)，保證了細(xì)胞的高活性。這為活細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)子的活性檢測(cè)以及細(xì)胞的行為關(guān)聯(lián)分析，提供了便捷的研究平臺(tái)（圖3）。

圖3 納米電穿孔探針平臺(tái)檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)CCAT1增強(qiáng)子活性：（A）PH探針檢測(cè)細(xì)胞的熒光圖像；（B）細(xì)胞熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；（C）采用siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，使用納米電穿孔探針平臺(tái)檢測(cè)得到的細(xì)胞熒光圖像；（D）利用CCK8試劑盒對(duì)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行鑒定；（E）細(xì)胞遷移一段時(shí)間后的劃痕區(qū)域，以表征細(xì)胞的遷移行為。

為了驗(yàn)證該平臺(tái)的性能，該團(tuán)隊(duì)在22個(gè)臨床原代細(xì)胞樣本中鑒定了CCAT1增強(qiáng)子的活性，并發(fā)現(xiàn)在肺癌原代細(xì)胞中CCAT1增強(qiáng)子的活性較正常肺癌細(xì)胞明顯增加，且不同細(xì)胞樣本間存在異質(zhì)性（圖4）。

圖4 臨床細(xì)胞樣本中增強(qiáng)子活性的鑒定：（A）檢測(cè)原代細(xì)胞樣本L1和N1的熒光圖像；（B）計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果；（C）原代肺腫瘤細(xì)胞樣本與原代正常肺細(xì)胞樣本的熒光強(qiáng)度比值比較；（D）CCAT1在原代肺腫瘤細(xì)胞（L1-L11）和原代正常肺細(xì)胞（N1-N11）中的表達(dá)比較。

該研究工作第一作者是萬(wàn)鳳奇博士，共同第一作者董再再博士。通訊作者北航常凌乾教授、董再再博士。文章第一單位為北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，合作單位為蘭州大學(xué)第二醫(yī)院與北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院。

審核編輯：郭婷