濱松光子學(xué)株式會(huì)社的科學(xué)家們根據(jù)彎曲樣品的表面形狀，使用濱松LCOS-SLM進(jìn)行激發(fā)光波前調(diào)制，從而使雙光子激發(fā)顯微鏡(TPM)(物鏡為干鏡)可以進(jìn)行高質(zhì)量的深度觀察。當(dāng)空氣和樣品之間的折射率界面是垂直于光軸的平面時(shí)，通常會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的球差。彎曲的樣品表面形狀和折射率不匹配會(huì)引起包括球差在內(nèi)的各種像差。因此，所獲得的圖像的熒光強(qiáng)度和分辨率在樣品的一定深度處變得很差。為了解決這個(gè)問(wèn)題，濱松中央研究所及濱松大學(xué)的科學(xué)家Naoya Matsumoto, Alu Konno, Takashi Inoue 及 Shigetoshi Okazaki等人設(shè)計(jì)了一種預(yù)畸變波前，以通過(guò)使用全新的光程差算法來(lái)校正由彎曲的樣品表面形狀引起的像差。在通過(guò)折射率不匹配的界面之前，TPM系統(tǒng)中包含的空間光調(diào)制器將激發(fā)光波前調(diào)制為預(yù)畸變波前。因此，激發(fā)光經(jīng)過(guò)樣品后聚焦時(shí)就沒(méi)有像差。由此，通過(guò)使用干物鏡在清潔的小鼠腦中觀察到高達(dá)2,000μm的光學(xué)深度的血管。

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的發(fā)展，人類社會(huì)也一直在推進(jìn)生物機(jī)能和疾病發(fā)病機(jī)理的研究。但是由于以往的觀察手段具有一定的局限性，對(duì)未作處理的動(dòng)物內(nèi)臟更深部結(jié)構(gòu)的3D觀察需求日益增長(zhǎng)。

雙光子激發(fā)顯微成像是一種通過(guò)用超短脈沖激光激發(fā)(照射)熒光物質(zhì)來(lái)觀察激發(fā)的熒光的技術(shù)。 普通的光，通過(guò)散射和吸收是無(wú)法達(dá)到樣本深部的，而激發(fā)光可以，故激發(fā)光是3D觀察的有效手段。但是，對(duì)于實(shí)際生物體來(lái)說(shuō)，因組織本身發(fā)生的像差而導(dǎo)致無(wú)法觀察深處部位。雖然如前面介紹的自適應(yīng)光學(xué)器件可以消除相差，但這與眼底成像不同，因?yàn)楦鞣N各樣的原因不適用顯微鏡觀察，只能在限定的條件下使用。

濱松公司搭建了搭載SLM的雙光子激發(fā)顯微鏡，在此基礎(chǔ)上研究像差補(bǔ)償?shù)姆椒?。首先，我們需要知道的是波前畸?像差)。 由于這樣的系統(tǒng)很難應(yīng)用自適應(yīng)光學(xué)，因此無(wú)法使用波前傳感器進(jìn)行測(cè)量。另外，與在激光加工中待加工的樣品不同，作為在顯微成像中待觀察的生物活體不僅形狀不確定，其內(nèi)部也有復(fù)雜的折射率分布，從而不能計(jì)算像差(圖1左)。因此，我們假設(shè)活體內(nèi)的折射率是一定的，將復(fù)雜的表面作形狀近似的簡(jiǎn)單處理，在相似的條件下，通過(guò)較少的參數(shù)(平均折射率、形狀的相似系數(shù)等)設(shè)計(jì)了全新的像差計(jì)算方法。

圖1 在顯微鏡下觀察的生物樣品(左)和近似模型(右)的波前畸變(像差)

圖2顯示的是采用我們像差計(jì)算方法來(lái)觀察生物樣品的結(jié)果。樣品是采用市面上銷售的液體透明化處理的小鼠大腦(a)。在過(guò)去大約10年左右的時(shí)間里，透明技術(shù)得到了快速的發(fā)展。這也是3D觀察需求大幅增加的一個(gè)重要原因。

圖2鼠腦預(yù)掃描結(jié)果

·(a,b)熒光染料(Dil)染色的鼠腦照片。使用光學(xué)清潔介質(zhì)(SeeDB)增強(qiáng)光學(xué)透過(guò)率。測(cè)量位置靠近(a)中藍(lán)色箭頭指示的位置。

·在不同的觀察區(qū)域時(shí)——淺表區(qū)域(c)與深層區(qū)域(d)——激發(fā)光穿過(guò)樣品表面的面積與樣品的尺寸間的關(guān)系。黃圈表示激發(fā)光穿過(guò)的面積，紅色虛線框表示預(yù)掃描的范圍。

·(e)為XY面的圖像，深度距離起始測(cè)量位置210μm。比例尺單位為200μm.

·(f)為計(jì)算所得樣品表面形狀。

圖3中間左列(a)，(b)和(c)是用新的像差校正方法獲得的三維成像圖片，讀取的不同深度的XY軸的成像圖像。與右列沒(méi)有進(jìn)行像差補(bǔ)償?shù)?d)，(e)和(f)相比，它的分辨率、信噪比(SNR)要高。通過(guò)查看(g)，(h)和(i)中的圖形所示的每個(gè)圖像的輪廓也可以看出進(jìn)行像差補(bǔ)償后的效果。如果不進(jìn)行像差補(bǔ)償，圖像的對(duì)比度會(huì)隨著深度的增加而降低，在最深(1,798 μm)處結(jié)構(gòu)就變得不清楚了。另一方面，如果做了像差補(bǔ)償?shù)脑?，即使在深處的結(jié)構(gòu)也可以獲得很好的成像。

雖說(shuō)雙光子激發(fā)顯微鏡適用于三維觀察，但是如結(jié)果所示，因?yàn)橄癫畹挠绊懀瑢?shí)際上普通的觀察是很難實(shí)現(xiàn)對(duì)深部成像的。 但是，通過(guò)使用我公司開(kāi)發(fā)的SLM進(jìn)行像差校正，可以觀察表面不平整的生物樣本的深處。 此外，因?yàn)橥瑫r(shí)照射多個(gè)點(diǎn)的高速成像和像差補(bǔ)償可以同時(shí)進(jìn)行，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中的高速成效效果是有目共睹的。

圖3鼠腦中血管的xy平面圖片。

(a,b) 400μm光學(xué)深度處使用SLM調(diào)制波前的圖像和未調(diào)制波前的圖像。 (c,d) 光學(xué)深度1116μm處的圖像。(e,f) 光學(xué)深度1798μm處的圖像。比例尺單位為50μm。虛線框?yàn)檠芫植糠糯?。通過(guò)SLM調(diào)制波前，大幅地提高了對(duì)比度和分辨率。

各種應(yīng)用的開(kāi)發(fā)

如此這般，通過(guò)采用SLM進(jìn)行波前控制，通過(guò)多點(diǎn)同時(shí)照射，實(shí)現(xiàn)高速成像，再通過(guò)像差補(bǔ)償?shù)玫礁咂焚|(zhì)成像，作為激光加工和成像的例子中已有所說(shuō)明。多點(diǎn)同時(shí)照射也用于對(duì)相鄰多個(gè)點(diǎn)同時(shí)照射，以引起相互作用并進(jìn)行特殊處理，對(duì)離開(kāi)活體的細(xì)胞和組織同時(shí)進(jìn)行光刺激。波前控制也為實(shí)現(xiàn)各種各樣的功能發(fā)揮作用，例如提高超出光學(xué)系統(tǒng)界限的分辨率(超分辨率)，生成從淺部到深部聚焦的特殊光束(非衍射光束)等。利用基于SLM的波前控制，除了可以輕松實(shí)現(xiàn)各種光學(xué)功能外，也可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)切換、同時(shí)多種功能。利用此特點(diǎn)，除了用于激光加工和成像外，還適用于各種目的和領(lǐng)域的研究，例如光學(xué)操縱、量子光學(xué)和太赫茲波的產(chǎn)生等等。另外，雖然此次沒(méi)有介紹，我們也有各種對(duì)于超短脈沖光的時(shí)間波形控制的研究。

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圖4 實(shí)驗(yàn)搭建

操縱模擬生物組織內(nèi)的光傳輸路徑

所用SLM型號(hào)：-07無(wú)水冷型號(hào)

應(yīng)用內(nèi)容：生物組織具有各向異性的物理特性，入射到其中的光會(huì)發(fā)生漫射現(xiàn)象。這也是我們無(wú)法看到生物組織內(nèi)部的主要原因。我們使用空間光調(diào)制器對(duì)入射光的波前進(jìn)行整形，有效地補(bǔ)償了光在生物組織內(nèi)部傳輸過(guò)程中所發(fā)生的波前畸變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)光傳輸路徑的操控。光經(jīng)生物組織實(shí)現(xiàn)聚焦是光路操縱的一種直觀形式，它對(duì)于激光掃描成像、激光靶向治療以及激光顯微操縱等應(yīng)用都具有重要意義。

圖5兩幅分別為使用濱松空間光調(diào)制器調(diào)制前后的圖。左圖為高斯光打到樣品上(使用氧化鋅模擬生物樣品)，激光被樣品散射所得到的散斑;右圖為經(jīng)過(guò)客戶算法調(diào)制后的光斑，使用濱松空間光調(diào)制器調(diào)制，調(diào)制后可見(jiàn)一個(gè)聚焦很好的點(diǎn)，為算法重構(gòu)的點(diǎn)。

圖5 實(shí)驗(yàn)效果

審核編輯黃宇