本文由昊量光電翻譯整理，文章內(nèi)容由華盛頓大學化學系的 Brian Wong 和 Dan Fu 提供，并由Liquid公司提供原文。

一

簡介

拉曼散射光譜為生物分子的特異性檢測和分析提供了化學鍵的固有振動指紋。那么什么是受激拉曼散射顯微鏡？受激拉曼散射(SRS)顯微技術(shù)是一種相對較新的顯微技術(shù)，是一種相干拉曼散射過程，允許使用光譜和空間信息進行化學成像，由于相干受激發(fā)射過程能產(chǎn)生約103-105倍的增強拉曼信號，可以實現(xiàn)高達視頻速率(約25幀/s)的高速成像。SRS顯微鏡繼承了自發(fā)拉曼光譜的優(yōu)點, 是一種能夠快速開發(fā)、label-free的成像技術(shù)，同時具有高靈敏度和化學特異性, 在許多生物醫(yī)學研究的分支顯示出應用潛力,包括細胞生物學、脂質(zhì)代謝、微生物學、腫瘤檢測、蛋白質(zhì)錯誤折疊和制藥。特別的是，SRS在對新鮮手術(shù)組織和術(shù)中診斷的快速組織病理學方面表現(xiàn)出色，與傳統(tǒng)的H&E染色幾乎完全一致。此外，SRS能夠根據(jù)每個物種的光譜信息，對多種組分的混合物進行定量化學分析。

盡管在之前的研究中已經(jīng)研究了痛風中MSU的自發(fā)拉曼光譜，但微弱的信號強度阻礙了其用于快速組織學的應用。因此，復旦大學附屬華山醫(yī)院華英匯教授 和復旦大學物理學系季敏標教授團隊將受激拉曼散射顯微技術(shù)用于人體痛風組織病理成像。研究人員應用SRS和二次諧波（SHG）顯微鏡同時表征了晶型和非晶型MSU。在普通光鏡下，MSU晶體呈典型的針狀。這些晶體在拉曼峰630 cm-1的SRS上很容易成像，當SRS頻率稍微偏離振動共振時，表現(xiàn)出了高化學特異性的非共振行為，SRS信號消失。已知SHG對非中心對稱結(jié)構(gòu)敏感，包括MSU晶體和組織中的膠原纖維。然而，由于拉曼極化率張量和二階光學磁化率對晶體對稱性的依賴，研究者們發(fā)現(xiàn)線偏振光光束在晶體取向上傾向于產(chǎn)生SRS和SHG的強各向異性信號。因此，研究者們對泵浦光束和斯托克斯光束都應用了圓偏振，以消除MSU晶體和膠原纖維的定向效應。

Moku:Pro 的鎖相放大器 (LIA) 為受激拉曼散射 (SRS) 顯微鏡實驗中的自外差信號檢測提供了一種直觀、精確且穩(wěn)健的解決方案。高質(zhì)量的 LIA 是 SRS 顯微鏡實驗中具有調(diào)制傳輸檢測方案的關(guān)鍵硬件組件。在此更新的案例研究中，我們提供了有關(guān)雙 LIA 應用程序的更多詳細信息和描述。

由于SRS 是一種相干拉曼散射過程，允許使用光譜和空間信息進行化學成像。它使用兩個同步脈沖激光器，即泵浦和斯托克斯（圖 1）相干地激發(fā)分子的振動。當入射到樣品上的兩束激光的頻率差與目標分子的振動頻率相匹配時，就會發(fā)生 SRS 過程。振動激發(fā)的結(jié)果是泵浦光束將失去光子，而斯托克斯光束將獲得光子。當檢測到泵浦光束的損失時，這稱為受激拉曼損失 (SRL) 檢測。強度損失 ΔI?/I? 通常約為 10 -7 -10 -4，遠小于典型的激光強度波動。為了克服這一挑戰(zhàn)，需要一種高頻調(diào)制和相敏檢測方案來從嘈雜的背景中提取 SRS 信號。在 SRL 檢測方案中，斯托克斯光束以固定頻率調(diào)制，由此產(chǎn)生的調(diào)制傳輸?shù)奖闷止馐?LIA 檢測。

檢測到由于 SRS 引起的 Stokes 到泵浦光束的調(diào)幅傳輸。演示的泵浦光束具有 80 MHz 的重復率，Stokes 光束具有相同的 80 MHz 重復率，但也以 20 MHz 進行調(diào)制。Δpump 是 LIA 在此檢測方案中提取的內(nèi)容。

圖 1：受激拉曼損耗檢測方案

圖1檢測到由于 SRS 引起的 Stokes 到泵浦光束的調(diào)幅傳輸。演示的泵浦光束具有 80 MHz 的重復率，Stokes 光束具有相同的 80 MHz 重復率，但也以 20 MHz 進行調(diào)制。Δpump 是 LIA 在此檢測方案中提取的內(nèi)容

二

實驗裝置

使用的激光系統(tǒng)能夠輸出兩個 80 MHz 的激光脈沖序列：斯托克斯光束在 1030 nm，泵浦光束在 790 nm。激光輸出也用于同步調(diào)制：80 MHz 參考被發(fā)送到分頻器以生成 20 MHz TTL 輸出。這些 20 MHz 輸出被使用兩次：一次作為電光調(diào)制器調(diào)制斯托克斯光束的驅(qū)動頻率，另一次作為外部鎖相環(huán)的 LIA 輸入通道 2（B 中）的參考。泵浦光束由硅光電二極管檢測，然后被發(fā)送到 LIA 的輸入通道 1（In A）。來自輸出通道 1（Out A）的信號被發(fā)送到數(shù)據(jù)采集卡以進行圖像采集。來自輸出通道 2 (Out B) 的信號被最小化（通過調(diào)整相移）。

2.1 單通道鎖相放大器配置

圖 2：典型的鎖定放大器配置設置

圖 2 演示了用于 SRS 顯微鏡實驗的 LIA 的初始設置。在初始設置時，必須重新獲取鎖相環(huán)。輸入均配置為 AC：50 歐姆。通過調(diào)整相位度數(shù)優(yōu)化相移 (Df)，直到 Out A 最大化（正值）并且 Out B 最小化（接近零）。探針A顯示對應于 DMSO 最高信號峰 (2913 cm-1 ) 的 SRS 信號，并最大化輸出 A 的 103.3 mV。探針B表示正交輸出，最小化為零。一旦 LIA 針對校準溶劑進行了優(yōu)化，樣品就可以進行成像了。

圖 3：2930 cm -1拉曼躍遷處的 SRS HeLa 細胞圖

圖 3 是使用 Moku:Pro 鎖相放大器拍攝的 HeLa 細胞圖像。顯示的圖像是從 SRS 圖像生成的，拉曼位移為 2930cm-1，對應于蛋白質(zhì)峰。低通濾波器設置為 40 kHz，對應于 約4μs 的時間常數(shù)。可以根據(jù)SRS信號大小增加或減少增益。

2.2 雙通道成像

Moku:Pro 的 LIA 也適用于實時雙色 SRS 成像。這是通過在 SRS 成像中應用正交調(diào)制并檢測LIA的X和Y輸出來執(zhí)行的。在這種情況下，斯托克斯調(diào)制有兩個部分：一個 20 MHz 脈沖序列生成SRS信號，另一個 20 MHz 脈沖序列具有90°相移，生成另一個針對不同拉曼波段的SRS信號。由于90°相移，兩個通道（Out A和Out B）彼此正交，可以同時獲取兩個SRS圖像而不會受到干擾。

圖 4：使用正交調(diào)制和輸出在兩個不同的拉曼躍遷下同時獲得鼠腦樣本的雙通道 SRS 圖像

圖 4 是利用雙通道X&Y輸出同時在2930 cm -1和 2850 cm -1處生成兩個 SRS 圖像的代表性圖像。

2.3多儀器模式應用

在大多數(shù) SRS 顯微鏡實驗中，由于激光器總帶寬的限制，光譜范圍被限制在大約 300 cm -1左右。繞過這一技術(shù)障礙的一種方法是使用可調(diào)諧激光器掃描波長。然而，波長調(diào)諧速度很慢，而且對于時間敏感的實驗（如活細胞成像）來說往往不夠。應對這一挑戰(zhàn)的另一種解決方案是引入第三束激光束來掃描不同的拉曼過渡區(qū)域。這種能力對于兩個光譜區(qū)域的同時成像特別有吸引力：一個在指紋區(qū)域（例如 約1600 cm-1用于酰胺振動）和一個在CH區(qū)域（例如 約2900 cm -1蛋白質(zhì)）。在 SRL 成像方法中，實驗裝置由一個斯托克斯光束和兩個不同波長的泵浦光束組成。此設置的常用檢測方法需要單獨的檢測器和單獨的 LIA。然而，Moku:Pro 的多儀器模式允許部署多個LIA，因此可以在不需要任何額外硬件妥協(xié)的情況下實施第二個LIA。

圖 5：Moku:Pro 多儀器鎖相放大器配置

圖 5 演示了LIA 的多儀器模式設置，用于同步 SRS 顯微鏡實驗。對于Slot 1，In 1是第一個光電二極管的檢測信號，In 2是參考信號，Out 1是發(fā)送到數(shù)據(jù)采集卡的信號，Out 3被丟棄。對于 Slot 2，In 3 是第二個光電二極管的檢測信號，In 2 再次作為參考，Out 2 是發(fā)送到數(shù)據(jù)采集卡的信號，Out 4 被丟棄。此配置僅使用 4 個 Moku 插槽中的 2 個。插槽 3 和 4 未分配，因此可用于進一步的 LIA 或任何其他 Moku 儀器。輸入全部配置為 AC：50 歐姆。每個 LIA 插槽（1 和 2）都遵循與單通道 LIA 配置相同的設置。

在三個激光器的情況下，Moku:Pro 的多儀器模式可以配置兩個鎖定放大器，將系統(tǒng)簡化為一個設備，而不會有任何妥協(xié)。這使得研究人員可以同時拍攝兩張波數(shù)差較大的 SRS 圖像，利用一個 Moku:Pro 來處理兩個光電二極管檢測器信號。

圖 6：HeLa 細胞 SRS 圖像使用多儀器設置在間隔較遠的拉曼躍遷處拍攝

圖 6 是利用一個Moku:Pro處理兩個光電二極管檢測器信號同時拍攝兩個大波數(shù)差的 SRS 圖像的代表性圖像。

三

結(jié)論

Moku:Pro 的 LIA 為大量 SRS 顯微鏡實驗提供了出色的解決方案。在本文檔中，討論了典型的單通道 SRS 成像、雙通道成像和多儀器成像。用戶界面允許對提取低強度 SRS 信號進行直觀和強大的控制。重要的是 Moku:Pro 的多儀器工具功能允許在多儀器同用的緊湊型系統(tǒng)上進行復雜的成像實驗。

圖 7：Moku:Pro 在多樂器模式下的使用圖像

圖 7中In 1 和 In 3 分別是插槽 1 和插槽 2 中 LIA 的信號輸入。2 中是兩個 LIA 插槽的參考。在所示的配置中，Out 1 和 Out 3 是記錄的信號，Out 2 和 Out 4 是插槽 1 和 2 的轉(zhuǎn)儲信號。