癌癥作為全球第二大死因，每年導致約1千萬人死亡。循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）是指從原發(fā)腫瘤病灶脫落并進入外周血液循環(huán)的各類腫瘤細胞，被認為是癌癥轉(zhuǎn)移的重要標志物。CTCs在腫瘤早期就已出現(xiàn)，并攜帶腫瘤大量的實時信息，因此CTCs檢測在癌癥研究中受到了越來越廣泛的關(guān)注。然而，由于血液中CTCs數(shù)量極少，1mL全血中僅含有1 ~ 10個CTCs，高效分離并準確測定全血樣品中的CTCs存在巨大困難。近年來，微流控芯片技術(shù)已發(fā)展成為一種極具潛力的從血液中分選富集CTCs的技術(shù)。CTCs分選性能在很大程度上取決于芯片的設(shè)計，因此，設(shè)計并搭建分選性能優(yōu)異、操作簡便的微流控芯片平臺至關(guān)重要。

近期，武漢大學胡斌教授課題組報道了一種基于磁性探針的級聯(lián)相轉(zhuǎn)移多功能微流控芯片平臺，通過與電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）聯(lián)用，成功實現(xiàn)CTCs的高活性分選、純化、釋放和定量檢測，相關(guān)成果以“ACascaded Phase-Transfer Microfluidic Chip with Magnetic Probe for High-ActivitySorting, Purification, Release, and Detection of Circulating Tumor Cells”為題發(fā)表在國際化學權(quán)威雜志AnalyticalChemistry上。

研究人員構(gòu)建了一個多功能級聯(lián)相轉(zhuǎn)移微流控芯片平臺，該芯片集被動分選和主動分選于一體，主要由分選區(qū)、純化區(qū)和釋放區(qū)三個功能區(qū)組成。實驗原理如圖1所示，CTCs在微流控芯片中經(jīng)歷分選、純化和釋放，之后引入ICP-MS檢測實現(xiàn)對其的準確定量。首先，將EpCAM適配體修飾的磁球與去除紅細胞的血液樣品共孵育一段時間，實現(xiàn)磁性探針對CTCs的識別和捕獲，隨后將其從入口樣品處引入芯片。在細胞分選區(qū)域，CTCs在中心強磁場和螺旋通道的共同作用下，迅速從寬分布狀遷移至通道內(nèi)壁，并沿著內(nèi)側(cè)從第一個分選口處進入細胞純化區(qū)，此時大量血細胞則從出口1流出，實現(xiàn)CTCs的初步分選。同時，另一入口通入的PBS緩沖液將與進入純化區(qū)的CTCs樣品流形成穩(wěn)定的層流，CTCs在磁力和流體動力的共同作用下，從樣品流相轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中，而剩余血細胞則保持在原樣品流中從出口2流出，完成CTCs的進一步純化。核酸酶溶液從核酸酶入口處通入，與含有CTCs的PBS流在釋放區(qū)形成穩(wěn)定的層流。在鋸齒狀的芯片結(jié)構(gòu)和矩形磁鐵的磁場作用下，CTCs再次相轉(zhuǎn)移至酶溶液中，并在強磁場作用下被固定在鋸齒凹槽內(nèi)。此時，持續(xù)流動的酶溶液不斷酶解磁球與細胞之間連接的適配體，最終磁球留在鋸齒凹槽內(nèi)，而細胞從磁球上脫離后則隨酶溶液從出口3流出，實現(xiàn)溫和的CTCs釋放。將CTCs收集，可用于后續(xù)ICP-MS定量檢測或再培養(yǎng)等下游分析。

圖1 級聯(lián)相轉(zhuǎn)移多功能微流控芯片的設(shè)計及CTCs捕獲、分選、純化、釋放和ICP-MS檢測原理圖

隨后，研究人員分別考察了CTCs分選純化區(qū)芯片和CTCs釋放區(qū)芯片的可行性。將磁性探針結(jié)合的CTCs和含有紅色墨水的PBS緩沖液分別引入分選純化區(qū)芯片，并在顯微鏡下觀察細胞在芯片中的遷移，結(jié)果如圖2A ~ 2C所示。在第一個分選口處、相轉(zhuǎn)移過程中和第二個分選口處，均能觀察到CTCs沿著預設(shè)的路徑發(fā)生轉(zhuǎn)移，并最終從目標出口流出，表明分選純化區(qū)的設(shè)計可行。同樣地，將磁性探針結(jié)合的且Hoechst預染色的CTCs和核酸酶溶液分別從兩個入口引入釋放區(qū)芯片，如圖2D ~ 2G所示，可以觀察到凹槽內(nèi)的CTCs先迅速積累，隨后逐漸被釋放，且目標出口所收集到的CTCs表面并未觀察到明顯的磁性顆粒，表明芯片釋放區(qū)可以成功實現(xiàn)CTCs的轉(zhuǎn)移、固定和釋放。

圖2 細胞分選和釋放的可行性

接著，研究人員對一系列實驗條件進行了優(yōu)化。在最優(yōu)的條件下，細胞捕獲、分選和釋放效率分別為84%、89%和94%（圖3A）。此外，研究人員考察了方法在PBS和血漿基質(zhì)中對CTCs的回收率，從圖3B可以看出，不同密度CTCs下，兩種基質(zhì)中的細胞回收率都相對穩(wěn)定且保持較高水平（75% ~ 80%），展現(xiàn)了該方法較強的抗基質(zhì)干擾能力。通過AO/EB雙染實驗進一步考察了所回收CTCs的細胞活性，存活率高達99.3%。隨后，研究人員探究了該方法的特異性，如圖4所示，結(jié)果表明本方法對EpCAM表達陽性的細胞具有良好的特異性，同時對EpCAM表達陰性的細胞具有較強的抵抗力。

圖3 （A）最佳條件下MCF-7細胞在PBS中的細胞捕獲、分選和釋放效率；（B）不同密度MCF-7細胞在PBS和血漿中的細胞回收率

圖4 方法特異性

為了驗證該方法在實際血樣中的分析能力，在實際血樣中加標不同數(shù)量的MCF-7細胞，采用本方法測定了加標血樣中MCF-7細胞的個數(shù)。從圖5A中可以看到，檢測到的MCF-7細胞的個數(shù)與加標的MCF-7細胞的個數(shù)呈較好的相關(guān)性，表明該方法具備良好的臨床應用潛力。最后，將所構(gòu)建的方法用于16名乳腺癌患者和4名健康人全血樣本檢測。如圖5B ~ 5C所示，在16例患者中，CTCs均有檢出（6 ~ 241個/mL），且明顯高于健康人血液中的平均CTCs個數(shù)（0.5個/mL）。


圖5 （A）不同數(shù)量MCF-7細胞血樣加標的ICP-MS檢測結(jié)果；16例乳腺癌患者和4例健康人1 mL全血中CTCs計數(shù)的（B）柱狀圖和（C）箱形圖

綜上所述，本工作設(shè)計了一種基于磁性探針的級聯(lián)相轉(zhuǎn)移微流控芯片，用于CTCs的分選、純化和釋放，通過ICP-MS測定細胞內(nèi)源性元素鋅（Zn），實現(xiàn)了CTCs細胞的高靈敏度檢測。這種微流控芯片設(shè)計簡單，集成化高，既包含適配體修飾磁性探針介導下的主動分選，又包含螺旋通道和鋸齒凹槽引起的被動分選。

此外，在所設(shè)計的微流控芯片中，CTCs發(fā)生級聯(lián)相轉(zhuǎn)移，從樣品相轉(zhuǎn)移至PBS實現(xiàn)分離和純化，再轉(zhuǎn)移至核酸酶溶液中實現(xiàn)釋放，其CTCs的分選、純化和釋放效率高。在實際血樣中，CTCs的加標回收率為84%，白細胞的數(shù)量從10?數(shù)量級減少至100個左右。所建立方法被成功地應用于乳腺癌患者血液樣本中CTCs的檢測。此外，采用內(nèi)源性元素標簽策略和從細胞表面溫和去除磁性探針顯著提高了細胞活力，回收的細胞活性高達99.3%。綜上所述，所構(gòu)建的方法在癌癥的早期診斷、腫瘤進展監(jiān)測和腫瘤預后評估等臨床應用方面表現(xiàn)出巨大的應用潛力。

審核編輯：劉清