拉曼光譜學(xué)（Raman spectroscopy）提供了一種微尺度下對(duì)化學(xué)成分的無(wú)損、無(wú)標(biāo)記定量研究手段?，F(xiàn)有的拉曼光譜儀微型化策略主要存在以下問(wèn)題：光譜分辨率及光譜范圍不足、高水平傳感器暗噪聲導(dǎo)致的信噪比（SNR）受限、傳感器像素間的量子效率（QE）變化較大、共焦性或深度分層差、激光波長(zhǎng)和激光器光功率不穩(wěn)定、激光光學(xué)反饋靈敏度高以及功耗高。

據(jù)麥姆斯咨詢(xún)報(bào)道，近日，丹麥技術(shù)大學(xué)（Technical University of Denmark）的科研團(tuán)隊(duì)提出了一種厘米級(jí)微型拉曼光譜儀，采用了經(jīng)濟(jì)型非穩(wěn)定激光二極管、密集光學(xué)元件和非制冷小型傳感器。其性能可與昂貴、體積龐大的科研級(jí)拉曼系統(tǒng)相媲美。該微型拉曼光譜儀具有出色的靈敏度、低功耗、完美的波數(shù)以及強(qiáng)度校準(zhǔn)，并在400 ~ 4000 cm?1范圍內(nèi)利用內(nèi)置參考基準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)了7 cm?1的分辨率。該微型拉曼光譜儀的高性能和通用性在應(yīng)用實(shí)例中得到了證明，應(yīng)用實(shí)例包括飲品中甲醇的定量測(cè)定、人體皮膚的活體拉曼測(cè)量、發(fā)酵監(jiān)測(cè)、亞微米分辨率的化學(xué)拉曼映射、抗癌藥物甲氨蝶呤（MTX）的定量表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）映射以及體外細(xì)菌鑒定等?？梢灶A(yù)見(jiàn)，這種微型化策略有望使超緊湊型拉曼光譜儀集成到智能手機(jī)和醫(yī)療設(shè)備中，從而推動(dòng)拉曼技術(shù)的普及。相關(guān)研究成果以“Optics miniaturization strategy for demanding Raman spectroscopy applications”為主題發(fā)表在Nature Communications期刊上。該論文的第一作者和通訊作者均為Oleksii Ilchenko。

拉曼光譜儀的微型化

拉曼系統(tǒng)的微型化主要包括：（1）光譜儀的微型化；（2）拉曼光束傳輸路徑的微型化；（3）激光光束傳輸路徑的微型化；（4）分束裝置的微型化；（5）采樣光學(xué)元件的微型化。因此，除光譜儀本身外，微型化還會(huì)影響激光器的選擇。這項(xiàng)研究從激光器相關(guān)問(wèn)題開(kāi)始闡述其微型拉曼光譜儀。

該研究所研制的微型拉曼光譜儀的光學(xué)方案如圖1a所示。近紅外（NIR）增強(qiáng)成像CMOS傳感器在800 ~ 960 nm波段同時(shí)采集了“指紋”范圍（400 ~ 2700 cm?1）的兩個(gè)拉曼光譜（即主通道和參考通道），如圖1c所示。

圖1 微型化拉曼系統(tǒng)的光學(xué)布局及工作原理

拉曼光譜儀的靈敏度很大程度上取決于探測(cè)器的暗噪聲。為了在不顯著降低靈敏度的前提下實(shí)現(xiàn)微型化，研究人員采用了具有4 μm小像素尺寸的CMOS傳感器，并使用高數(shù)值孔徑（NA）成像鏡頭（圖1a中的L6）將拉曼光譜信號(hào)壓縮到傳感器上的單行中（如圖2a）。信號(hào)壓縮帶來(lái)的好處主要有：（1）最大限度提高每個(gè)像素的信噪比；（2）避免對(duì)具有非必要額外暗噪聲的額外行進(jìn)行平均。實(shí)驗(yàn)顯示，SERS信號(hào)總強(qiáng)度等量分布在CMOS傳感器的20行中（如圖2b）。該微型拉曼光譜儀采用非波長(zhǎng)穩(wěn)定激光器，這使其能夠補(bǔ)償另一個(gè)靈敏度限制因素，即光譜傳感器像素間的QE變化（如圖2e）。

圖2 微型化拉曼系統(tǒng)的靈敏度和量化性能論證

這項(xiàng)研究采用了一種離軸激光光束傳輸方法，該方法避免了激光反向反射進(jìn)入激光孔徑，同時(shí)提高了微型化能力（如圖2h）。除了激光光學(xué)隔離外，離軸激光光束傳輸還支持空間偏移拉曼光譜（SORS）條件，使其避免樣品內(nèi)部離焦層產(chǎn)生不必要的熒光。

微型拉曼光譜儀的應(yīng)用實(shí)例

隨后，研究人員分別在五個(gè)應(yīng)用實(shí)例中證明了該微型拉曼光譜儀的高性能和通用性。

應(yīng)用實(shí)例一：伏特加中有毒甲醇的定量測(cè)定。為了證明該微型拉曼光譜儀的靈敏度和定量性能，研究人員對(duì)含有不同濃度甲醇的伏特加樣品進(jìn)行了測(cè)量。甲醇定量的偏最小二乘法（PLS）校準(zhǔn)結(jié)果如圖2l至圖2p所示，檢測(cè)限（LoD）為0.07%，定量限（LoQ）為0.25%。

應(yīng)用實(shí)例二：發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的定量測(cè)定。研究人員使用微型拉曼光譜儀對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的pHCA進(jìn)行離線定量測(cè)定，直接測(cè)量了細(xì)菌上清液樣品的拉曼信號(hào)（如圖3g）。結(jié)果表明，該微型拉曼光譜儀具有較高的靈敏度，pHCA的檢測(cè)限約為0.01 g/L，葡萄糖的檢測(cè)限約為1 g/L。

圖3 用于發(fā)酵監(jiān)測(cè)和活體皮膚測(cè)量的微型拉曼光譜儀

應(yīng)用實(shí)例三：活體皮膚測(cè)量?；铙w皮膚測(cè)量通常需要復(fù)雜的拉曼儀器，這是由于皮膚的拉曼橫截面較小，特別是在深度超過(guò)100 μm時(shí)，需要深度制冷傳感器。圖3j和圖3k展示了緊湊型皮膚探針。該探針可以?xún)?yōu)化不同深度的皮膚測(cè)量（0 ~ 150 μm）。當(dāng)微型拉曼光譜儀配備這種探針時(shí)，能夠采集10 ~ 20 μm深度的皮膚拉曼光譜，信噪比優(yōu)于500:1（1 s曝光時(shí)間，重復(fù)5次）。圖3n至3s顯示了兩種激光（785 nm和675nm）在不同皮膚區(qū)域（手指、手和臉頰）獲得的拉曼光譜。

該微型拉曼光譜儀的光學(xué)設(shè)計(jì)采用了交叉狹縫共焦概念（如圖4a和圖4b），可進(jìn)行共焦測(cè)量。該微型化拉曼顯微鏡是目前所報(bào)道的最小的共焦拉曼系統(tǒng)，其設(shè)計(jì)并未犧牲拉曼系統(tǒng)的基本性能。下面介紹了兩種具有挑戰(zhàn)性的拉曼顯微鏡應(yīng)用，這些應(yīng)用通常需要使用配備深度制冷傳感器的科研級(jí)系統(tǒng)。

圖4 用于生物醫(yī)學(xué)拉曼顯微鏡應(yīng)用的微型化拉曼系統(tǒng)

應(yīng)用實(shí)例四：通過(guò)SERS映射定量抗癌藥物。研究結(jié)果表明，采用配備深度制冷EMCCD的科研級(jí)拉曼顯微鏡進(jìn)行SERS映射的納米柱輔助分離（NPAS）方法，可以在5 ~ 150 μM的線性范圍內(nèi)測(cè)量PBS中的MTX，檢測(cè)限為5 μM，定量限為25 μM。研究人員還使用NPAS方法對(duì)SERS芯片表面進(jìn)行SERS映射（如圖4g）。

應(yīng)用實(shí)例五：體外細(xì)菌鑒定。在這方面，僅需一個(gè)步驟，拉曼光譜有望實(shí)現(xiàn)快速、無(wú)標(biāo)記、無(wú)培養(yǎng)的鑒定和抗菌藥敏試驗(yàn)（AST）。本實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用該微型化拉曼顯微鏡來(lái)測(cè)量與之前發(fā)表報(bào)道中完全相同的細(xì)菌分離物，當(dāng)時(shí)研究使用了配備深度制冷CCD的科研級(jí)拉曼顯微鏡（如圖4n），同時(shí)采用了完全相同的樣品制備過(guò)程和數(shù)據(jù)分析，測(cè)得的不同細(xì)菌的拉曼光譜如圖4m所示。

綜上所述，這項(xiàng)研究的基本策略是圍繞拉曼頻移和激光強(qiáng)度的內(nèi)置實(shí)時(shí)校準(zhǔn)，并通過(guò)多種數(shù)據(jù)處理算法輔助來(lái)實(shí)現(xiàn)拉曼光譜儀的微型化。此外，該微型化策略還包括：降低傳感器暗噪聲、補(bǔ)償像素間的QE變化、激光光學(xué)隔離以及保持高光譜分辨率。此外，該研究的微型化策略還提供了寶貴的移頻激發(fā)差分拉曼光譜（SERDS）和空間偏移拉曼光譜（SORS）功能。與典型的手持式拉曼設(shè)備相比，該光譜儀在光譜分辨率、信噪比、操作準(zhǔn)備時(shí)間、波數(shù)和強(qiáng)度校準(zhǔn)精度等大多數(shù)重要參數(shù)上均有改進(jìn)。此外，該微型光譜儀的整體性能可與高端臺(tái)式拉曼光譜儀和顯微鏡相媲美。該研究方法提供的高性能和廣泛適用性便于其簡(jiǎn)單集成到各類(lèi)儀器和多種應(yīng)用中。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-47044-7

審核編輯：劉清