1.3細胞培養(yǎng)裝置及細胞培養(yǎng)
將加工完成的芯片與溫度控制系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、信號檢測系統(tǒng)等整合成一個完整的細胞培養(yǎng)微系統(tǒng)，并在此微系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)PIEC。通過微量注射泵供給培養(yǎng)液,通過熒光顯微鏡完成信號檢測。
2.1.1 ITO玻璃的腐蝕 在傳統(tǒng)的玻璃微流控芯片制作工藝中，通常采用石英玻璃作為基質(zhì)材料,但其價格較為昂貴,制作工藝復雜，且刻蝕速率較慢，需要長時間的刻蝕才能獲得足夠的深度。為此,通常需要在玻璃表面沉積一層薄膜材料作為刻蝕掩模層，如氧化硅、氮化硅、多晶硅和金屬層。這些問題的存在極大地限制了玻璃在微流控芯片加工領域的應用。在此,我們采用商品化的ITO玻璃作為制作細胞培養(yǎng)芯片的基質(zhì)材料。ITO玻璃是鈉玻璃的一種，其所含的Na,O,CaO、MgO等雜質(zhì)成分可以大大加快玻璃濕法腐蝕的速度。同時,為了簡化制作工藝,降低成本，采用光刻膠AZ4620作為刻蝕掩模層;腐蝕液則采用1B稀釋的BOE液,最大刻蝕深度可達到110μm。如圖4所示,刻蝕時間與刻蝕深度呈較好的線性關系,平均刻蝕速度為066 μm/min。
212ITO玻璃腐蝕中鉆蝕效應的應用 如前所述,在設計細胞培養(yǎng)芯片時必須考慮培養(yǎng)液流動所導致的機械力影響。液體在微管道內(nèi)流動所形成的剪切力除了導致細胞形態(tài)改變之外,嚴重時甚至可能損傷細胞。為了克服這一問題，SarunasM ichael等在芯片設計時采用柵形”結(jié)構(gòu)隔離培養(yǎng)液進樣,出樣區(qū)域和細胞培養(yǎng)區(qū)域,有效成分通過柵形”結(jié)構(gòu)擴散完成,成功實現(xiàn)了HeLa細胞在芯片上的培養(yǎng)同。在此,我們則是利用玻璃在濕法刻蝕過程中的鉆蝕效應一次成型來獲得壩型”結(jié)構(gòu),優(yōu)化細胞培養(yǎng)芯片的設計。
玻璃濕法刻蝕是各向同性的，即刻蝕過程中腐蝕液不僅刻蝕掉深度方向的材料，而且?guī)缀跻酝瑯拥乃俣瓤涛g掉側(cè)壁的材料,我們稱之為鉆蝕效應。如圖1(6所示,若刻蝕時間較長,寬度較小的管道壁A將被腐蝕擊穿,形成壩型”結(jié)構(gòu),而寬度較大的管道壁B則未被刻穿。管道壁寬度越小,刻蝕時間越長，壩型”結(jié)構(gòu)的高度越小。圖5為使用臺階儀測得的壩型”結(jié)構(gòu),其掩模板為圖2刻蝕深度A為39μm,“壩型”結(jié)構(gòu)高度為31μm。底部D最寬為178μm培養(yǎng)液灌注通道的寬度C為161μm。圖6為使用femlab對芯片內(nèi)液體的流速模擬分析得到的結(jié)果，紅色為流速較大處,藍色為流速較小處;其中A、B幅為壩型”結(jié)構(gòu)下結(jié)構(gòu)圖管道中部分別與進樣方向平行、垂直的液體流速分布,左側(cè)為培養(yǎng)液進樣通道,右側(cè)為細胞培養(yǎng)區(qū)域;C.D幅為沒有壩型”結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果。由圖6可見,使用壩型”結(jié)構(gòu)可以明顯降低細胞培養(yǎng)區(qū)域液體的流速,從而減弱流體剪切力對細胞培養(yǎng)的影響。
2.2細胞培養(yǎng)芯片與其他結(jié)構(gòu)的整合
2.2.1溫度控制 溫度控制是細胞培養(yǎng)微系統(tǒng)的重要組成部分,培養(yǎng)溫度若不適當,將會影響細胞的代謝和生長,甚至使細胞死亡。目前,細胞芯片微系統(tǒng)的加熱源主要分為2類,即銅絲導電發(fā)熱的間接加熱方式和培養(yǎng)材料導電發(fā)熱的直接加熱方式四。為了滿足長期觀察和記錄細胞活動的需要,我們以 ITO玻璃上的 ITO薄膜為發(fā)熱材料,通過電極連入外部溫度控制系統(tǒng)?？刂葡到y(tǒng)以ADμC812單片機為硬件核心,以PID增量算法為軟件控制算法,主要包括溫度信號采集、放大、濾波、單片機處理和反饋控制等功能。實驗過程中，溫度控制目標為37℃，使用Pto00電極在芯片表面采集溫度數(shù)據(jù),上下波動小于05℃。
2.2.2 氣體供應 多數(shù)細胞需要在有氧條件下生長，一種可行的供氧方法是將培養(yǎng)液通過氧小室，溶解氧氣后再轉(zhuǎn)回至細胞培養(yǎng)芯片內(nèi),以此滿足細胞培養(yǎng)過程中所需要的氧氣。我們采用PDMS薄膜作為芯片的蓋片，除了利用它良好的生物兼容性之外，其高透氣性特點還可以滿足細胞培養(yǎng)過程中細胞對氧氣的需求同,使我們在培養(yǎng)時不需要增加額外的氣體供應裝置,簡化細胞培養(yǎng)微系統(tǒng)的整體設計。根據(jù)Eric等的公式計算,若芯片內(nèi)細胞每秒需氧量估計值為XPDMS薄膜所能提供的氧氣量每秒最大值為Fm。本實驗中，X約為1.36X10"mol/s Fm約為82X10mol/s F>>X,說明采用PDMS薄膜完全可以滿足細胞培養(yǎng)過程中細胞對氧的需求。
細胞體外培養(yǎng)時,除氧的供應外,一般還需要5%的CO2分壓。由于本微系統(tǒng)未使用專門的氣體供應設備,為此,我們采用改進細胞培養(yǎng)液的方法來滿足細胞生長過程中對CO?的需求，并提供穩(wěn)定的pH值.,添加LeibovitzsL-15培養(yǎng)基的培養(yǎng)液在光照下具有高的穩(wěn)定性，能夠為細胞生長提供穩(wěn)定的pH值,足量的NaHCO:還能滿足細胞對碳酸鹽的需求。
23芯片細胞培養(yǎng)測試
芯片用75%酒精浸泡1h取出后放入培養(yǎng)皿中,紫外燈照射lh。為了有利于細胞導入芯片后貼壁生長,在導入細胞之前，用注射器將培養(yǎng)液注入芯片內(nèi)部,將芯片浸潤,放置過夜,使芯片內(nèi)壁包壁一層蛋白。培養(yǎng)液采用1640培養(yǎng)基,將其與L-15培養(yǎng)基以1：1混合后，補充10%的胎牛血清、100ug/mL鏈霉素。用消化液25g/L胰蛋白酶,02g/LEDTA溶液)將常規(guī)培養(yǎng)的PIEC消化、離心、吹打,將細胞懸濁液的濃度調(diào)整到4X10°/mm,然后用注射器吸入細胞懸濁液,通過注射泵緩慢注入芯片內(nèi)。將此已導入細胞的芯片和上述溫度控制系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、視頻觀察記錄系統(tǒng)相連，細胞在2~3h后貼壁生長。圖7為培養(yǎng)72h后的細胞,其生長情況良好;圖8為CCD記錄的細胞貼壁過程中形態(tài)的變化。
24結(jié)語
本文介紹了一種利用ITO玻璃快速、低成本制作細胞培養(yǎng)芯片的方法。利用玻璃濕法刻蝕過程中的鉆蝕效應,在芯片內(nèi)加工出“壩型”結(jié)構(gòu),以分隔培養(yǎng)液進樣通道和細胞培養(yǎng)區(qū)域,減弱了培養(yǎng)液灌注過程中所產(chǎn)生的流體剪切力對細胞生長的影響。將此芯片與透氣性的PDMS薄膜鍵合,并整和溫度控制系統(tǒng)、視頻觀察系統(tǒng)等,實現(xiàn)了PIEC在體外的培養(yǎng),為下一步研究細胞遷移特性等提供了良好的基礎。
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審核編輯 黃宇