細(xì)胞內(nèi)的鈣離子成像是細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的重要技術(shù)之一。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，本身在各種細(xì)胞內(nèi)生理過程中就起到著關(guān)鍵作用，例如細(xì)胞分裂與增值、信號(hào)傳導(dǎo)以及凋亡與壞死等等。而熒光染料的使用是研究單個(gè)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)力學(xué)的最有效和最流行的工具。使用化學(xué)熒光指示劑或熒光蛋白指示劑來檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。當(dāng)這些指示劑與Ca2+結(jié)合后，會(huì)改變其熒光特性（熒光增強(qiáng)、光譜位移），進(jìn)而通過顯微鏡被觀察到，從而間接反映細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài)，提示神經(jīng)元活動(dòng)。

而為鈣離子成像選擇光源時(shí)，除了根據(jù)Ca2+指示劑所需的激發(fā)波長，例如Fura-2需要340nm和380nm，而Fluo-4需要488nm，還需要根據(jù)具體的成像類型。如單波長強(qiáng)度成像（Fluo-4）以及需要雙波長的比率成像（Fura-2）。鈣離子成像本質(zhì)上也是一種活細(xì)胞成像技術(shù)，因此為了避免光毒性以及光漂白效應(yīng)，也需要盡量減少激發(fā)光的暴露，對于光源的功率有調(diào)控的需求。

比率成像（Calcium Ratio Imaging）

比率成像（也稱為比例成像）正是利用指示劑結(jié)合Ca2+后發(fā)生的光譜位移而非純粹的光強(qiáng)變化來進(jìn)行定量檢測的。比率型熒光探針在與Ca2+結(jié)合前后其激發(fā)或者發(fā)射的光譜會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而可通過不同波長的熒光發(fā)射或激發(fā)比確定Ca2+濃度。與單波長探針相比，比率型熒光探針的主要優(yōu)點(diǎn)是比率信號(hào)與染料濃度、照明強(qiáng)度等因素?zé)o關(guān)，受偽影的干擾小，避免了誤判Ca2+濃度，能獲得更為精確的結(jié)果。

需要注意的是，有時(shí)為了捕捉Ca2+濃度在細(xì)胞內(nèi)的瞬態(tài)變化，需要在短時(shí)間內(nèi)切換光源的兩個(gè)波長，以確保兩個(gè)波長下的熒光強(qiáng)度測量能夠反映同一時(shí)間點(diǎn)的鈣離子濃度變化，減少時(shí)間偏差。

Fura-2熒光探針

Fura-2是一種常用的比率型熒光探針，屬于高親和力探針，其Ca2+結(jié)合態(tài)激發(fā)波長峰值為340nm，游離態(tài)為380nm，發(fā)射波長峰值不變，適用于數(shù)字成像顯微鏡、胞內(nèi)鈣儲(chǔ)門控Ca2+內(nèi)流研究以及與基因編碼探針聯(lián)合應(yīng)用。并且Fura-2的光穩(wěn)定性更強(qiáng)，產(chǎn)生較少的光漂白現(xiàn)象。

Lumencor RETRA固態(tài)光源

美國Lumencor公司生產(chǎn)的RETRA光引擎結(jié)合了兩個(gè)可單獨(dú)控制的固態(tài)LED光源和相應(yīng)波長的帶通濾光片，可產(chǎn)生所需的激發(fā)光輸出，并通過電子控制快速切換。根據(jù)特定應(yīng)用的要求，光譜輸出可以定制從紫外到可見光到近紅外。RETRA FURA光引擎是鈣離子比率成像的理想激發(fā)光源（Fura-2熒光探針），提供經(jīng)過優(yōu)化的340/380nm波段的輸出，功率可達(dá)數(shù)百毫瓦。并且Lumencor的配套的液體光波導(dǎo)（LLG）也優(yōu)化了紫外透過率，確保LED光源可以以較低損耗到達(dá)顯微鏡。

RETRA通過LLG輸出的測試情況

[1]包括光引擎、電源線、液體光導(dǎo)LLG和USB電纜。

[2]隨產(chǎn)品附帶。

[3]控制盒連接到光引擎的USB端口，并控制光源選擇、光輸出開關(guān)和強(qiáng)度設(shè)置。

Lumencor RETRA特點(diǎn)

外部控制：Lumencor光源提供豐富的外部通信接口，如RS232、USB、TTL等等，可以實(shí)現(xiàn)通道選擇、開關(guān)以及光強(qiáng)調(diào)整。適配您的二次開發(fā)需求。

快速切換：光源的切換時(shí)間可達(dá)~50μs（TTL控制）或者~50ms（串口控制）。這相比機(jī)械式濾光片輪來切換波長要快很多，可以快速捕捉鈣信號(hào)，確保較高的時(shí)間分辨率。

高亮度：輸出348nm LED可達(dá)250mW，而380nm LED可達(dá)300mW（光波導(dǎo)輸出端，和具體配置有關(guān)）

強(qiáng)度可調(diào)：作為活細(xì)胞成像的一種，為了避免光毒性和光漂白效應(yīng)，鈣離子成像也需要盡量減少激發(fā)光的過度照射。RETRA可以獨(dú)立線性調(diào)控各個(gè)組成光源的輸出功率，優(yōu)化圖像采集。

美國Lumencor致力于以富有創(chuàng)意和智慧的設(shè)計(jì)理念，制造出行業(yè)內(nèi)領(lǐng)先的照明設(shè)備和儀器，助客戶獲取高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。Lumencor提供廣泛的固態(tài)光源種類可選，應(yīng)用于生命科學(xué)、臨床科學(xué)、先進(jìn)材料和半導(dǎo)體工藝，并提供從完全定制的解決方案到即插即用的光引擎，滿足不同客戶的需求。

作為Lumencor在中國的代理商，上海昊量光電設(shè)備有限公司負(fù)責(zé)其產(chǎn)品在國內(nèi)的銷售、技術(shù)服務(wù)以及售前售后技術(shù)基礎(chǔ)，歡迎聯(lián)系我們，和Lumencor一同開啟一場光源的奇幻之旅。

Lumencor RETRA相關(guān)應(yīng)用論文

1. Fura-2細(xì)胞內(nèi)鈣成像用于DRG神經(jīng)元

Flayer C H, Kernin I J, Matatia P R, et al. A γδ T cell–IL-3 axis controls allergic responses through sensory neurons[J]. Nature, 2024, 634(8033): 440-446.

2. 小鼠垂體細(xì)胞的Fura-2鈣離子成像

Sokanovic S J, Constantin S, Lamarca Dams A, et al. Common and female-specific roles of protein tyrosine phosphatase receptors N and N2 in mice reproduction[J]. Scientific Reports, 2023, 13(1): 355.

3. 小鼠成纖維細(xì)胞中失調(diào)的鈣穩(wěn)態(tài)的340/380 nm Fura-2成像

Mondal A, Appu A P, Sadhukhan T, et al. Ppt1‐deficiency dysregulates lysosomal Ca++ homeostasis contributing to pathogenesis in a mouse model of CLN1 disease[J]. Journal of inherited metabolic disease, 2022, 45(3): 635-656.