圖 1： Line REscan AION 共聚焦顯微鏡配備兩臺 Kinetix sCMOS 相機，用于多色成像，在 3k x 3k 像素陣列上的速度超過 100 fps。

Line RE掃描 AION 共聚焦系統(tǒng)和 Kinetix 相機的結(jié)合為活細(xì)胞成像提供了無與倫比的功能。AION具有電動可切換針孔，可為具有大視野的各種物鏡提供精確的共聚焦。Kinetix 提供無與倫比的靈敏度和速度，量子效率 (QE) 高于 95%。這種組合非常適合活細(xì)胞成像，因為它能夠?qū)Υ髽悠愤M行高速圖像采集，并通過實時反卷積和降低光毒性來增強。這種適應(yīng)性強且用戶友好的系統(tǒng)支持同步雙相機成像，并與顯微鏡機身和軟件無縫集成，在共聚焦顯微鏡中提供前所未有的性能。

介紹

現(xiàn)代顯微鏡是突破生命科學(xué)領(lǐng)域人類知識界限的重要工具，隨著硬件或軟件的每一次新發(fā)展，它都會向前邁進一步。轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡是生命科學(xué)領(lǐng)域一種流行的成像方法，因為光學(xué)切片可在單焦平面內(nèi)提供更高的分辨率和更清晰的圖像。然而，活細(xì)胞轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡面臨局限性，需要更溫和的成像，具有更高的分辨率、更高的采集速率、更高的光譜靈敏度、更大的視場 (FOV) 等。

Confocal NL 的 Line RE掃描 AION 共聚焦裝置提出了一個顛覆性的概念，可在緊湊且經(jīng)濟高效的解決方案中實現(xiàn)高分辨率成像。任何成像設(shè)置的關(guān)鍵部分是探測器，Teledyne Photometrics 的 Kinetix 是一款突破性的現(xiàn)代背照式 sCMOS 相機，在速度和靈敏度之間取得了平衡，同時為大 FOV 成像提供了最大的商用傳感器之一。

在本文中，我們旨在強調(diào)這兩種技術(shù)的強大集成，強調(diào)它們?yōu)轱@微鏡提供的獨特優(yōu)勢。其結(jié)果是一種工程解決方案，能夠在大視場范圍內(nèi)同時在多達(dá)兩個探測器上進行高速成像，所有這些都具有最先進的共聚焦系統(tǒng)的分辨率和軸向切片。

新設(shè)置超越的限制

典型的sCMOS相機通常缺乏必須在高速下檢測微弱信號的應(yīng)用所需的靈敏度和采集速度。使用 Kinetix 可實現(xiàn)兩倍以上的采集速度，并且從可見光到近紅外 (NIR) 波長的 >95% 的高 QE 和最小的噪聲水平(< 1 e-read 噪聲)緩解了以前探測器遇到的瓶頸。Kinetix 傳感器(3200 x 3200 像素，6.5 μm 像素尺寸)在選擇放大設(shè)置和其他成像模式時提供了靈活性。該芯片的物理尺寸(對角線為 29.42 毫米，即 FN29)在每一幀中捕獲的數(shù)據(jù)比典型的 sCMOS 相機多得多，但需要與適當(dāng)?shù)拇?FOV 系統(tǒng)配對，以最大限度地發(fā)揮大型傳感器的優(yōu)勢。

AION 已針對大型樣品進行成像進行了優(yōu)化，并充分利用了 Kinetix 提供的大 FOV 和分辨率，從而提供了傳統(tǒng)系統(tǒng)兩倍以上的 FOV 尺寸。這確立了 AION 和 Kinetix 的硬件組合作為大量不同顯微鏡應(yīng)用的首選方法，利用更大的 FOV 或隨之而來的高速成像提供的更高的吞吐量。

圖2： 使用 100x 1.50 NA 物鏡將 FN18 系統(tǒng)與 AION 和 Kinetix 提供的 FN25 進行比較。圖像顯示了固定的人成纖維細(xì)胞，細(xì)胞核 - DAPI(藍(lán)色)，線粒體 - Tom20-Alexa488(綠色)，微管 - 微管蛋白 - Alexa555(紅色)，肌動蛋白 - Alexa647(洋紅色)。

AION 設(shè)計為在對角線為 25 mm(FN25)的 FOV 處完全衍射限制，適用于對應(yīng)于 60x 1.4 NA 或更小的物鏡孔徑。這意味著物鏡的 NA/Mag 值必須小于或等于 1.4/60，才能使用 FN25 FOV 提供衍射極限圖像。因此，與更常見的FN18系統(tǒng)相比，使用高放大倍率和高NA物鏡(例如100倍、1.45 NA)在啟用FN25 FOV的系統(tǒng)上成像時，將使樣品表面成像得兩倍(圖2)。AION還配備了可切換的針孔，為各種物鏡(4x-100x)實現(xiàn)了理想共聚焦。

圖 3： 使用 60x 1.42 NA 物鏡將 FN18 系統(tǒng)與 AION 和 Kinetix 提供的 FN25 進行比較。圖片顯示黑腹果蠅卵母細(xì)胞、微管 – Alexa 555。

與前代產(chǎn)品相比，AION優(yōu)化的光學(xué)器件和智能成像功能，結(jié)合Kinetix的速度和靈敏度，提高了共聚焦顯微鏡的質(zhì)量和通量。AION 有三個不同的版本(α、λ 和 Σ)，硬件配置不同，都可以適應(yīng)每個常見的顯微鏡輸出。該設(shè)計甚至通過結(jié)合兩個具有大視場的攝像機來同時對不同通道進行成像。當(dāng)與兩臺 Kinetix 相機一起使用時，每個通道可以對 25 mm 對角線 FOV(450 x 450 μm2,40 倍物鏡)的每秒 100 幀以上成像。使用動態(tài)反卷積可以實現(xiàn) 170 nm 的實時分辨率，從而在超過 500 μm 的深度生成高質(zhì)量圖像。針孔的電動化進一步提高了成像質(zhì)量，其他電動化和自動化功能促進了用戶友好性的提高。

AION提供的照明進一步支持了這種靈活性，該照明可以擁有多達(dá)兩倍的激發(fā)線數(shù)量，甚至可以達(dá)到近紅外(400-1100 nm)。高成像深度也是該系統(tǒng)的一大優(yōu)勢，可以通過使用更長的波長來減少更深樣品中的像差或散射。盡管是共聚焦系統(tǒng)，但與傳統(tǒng)系統(tǒng)相比，照明模式已得到改進，光毒性降低了數(shù)倍。此功能與活細(xì)胞應(yīng)用高度相關(guān)，活細(xì)胞應(yīng)用可以進行更長的持續(xù)時間，并且由于細(xì)胞在實驗過程中承受的損傷減少，因此更加可靠。該設(shè)置的安裝是用戶友好的，因為它使用開源軟件(如 Micro-Manager)實現(xiàn)所有元素。驅(qū)動程序可用于將硬件合并到其他控制軟件中或創(chuàng)建自定義解決方案。

結(jié)論

新型 Line RE掃描 AION 系統(tǒng)與多達(dá)兩臺 Kinetix 相機相結(jié)合，達(dá)到了共聚焦技術(shù)的頂峰(圖 1)。同時采集如此大的視場，結(jié)合高時空分辨率、實時反卷積和高成像深度，提供了一種具有前所未有的能力的成像工具。該系統(tǒng)具有很強的適應(yīng)性，這要歸功于其簡單的硬件和軟件對可用顯微鏡的實施以及緊湊的結(jié)構(gòu)。AION-Kinetix 組合作為尖端的高質(zhì)量共聚焦系統(tǒng)是無與倫比的。

審核編輯 黃宇