自Ash和Knoll等創(chuàng)立表面等離子體共振成像( Surface Plasmon Resonance Imaging, SPR I)技術(shù)以來, 使得生物分子點陣的無標(biāo)記并行檢測成為可能. 迄今為止, SPR I主要采用單波長激發(fā)光源, 檢測到的是單色或黑白圖像. 雖然利用多波長激發(fā)光源進行SPR I研究具有許多優(yōu)勢(比如彩色圖像鮮艷動人及信息含量高等) , 并在金屬膜等研究中有所應(yīng)用, 但在分子類樣品中的研究應(yīng)用的報道則很少, 原因可能在于沒有商品儀器且彩色信號復(fù)雜、分析難度大等方面. 為了探索其中的問題,并促進SPR I新方法的建立和發(fā)展, 我們自主設(shè)計并建立了彩色表面等離子共振成像(Color SPR I,CSPR I)實驗系統(tǒng), 并結(jié)合利用自己編制的軟件開展了相關(guān)研究, 成功地觀測到溶液和蛋白點陣的彩色圖像. 這些結(jié)果顯示, CSPR I有可能成為生物分子微點陣(或生物芯片)的一種新型的彩色顯示手段.

1實驗部分

1. 1試劑與儀器

巰基十一酸(Mercap toundecanoic acid, MUA)購自Aldrich公司(Milwaukee, USA) ;氮2羥基琥珀酰亞胺(N 2Hydroxysuccinimide, NHS)購自Acros公司(New Jersey, USA) ; 氮2乙基2氮′2 (二甲氨丙基) 碳二亞胺[ N 2Ethyl2N′2 ( dimethyaminop ropyl) carbodiimide, EDC ]購自Avocado ResearchChemicals Ltd. (Lancashire, UK) ; 牛血清白蛋白(BSA)購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司; 乙醇胺、無水乙醇及其它分析純試劑均購自北京化學(xué)試劑公司; 實驗用水為3次蒸餾水; 金膜采用真空噴鍍法在玻璃基底(折射率n = 11516)上鍍制而成, 膜厚約50 nm.

自行研制的CSPR I儀器的示意圖見圖1, 其中的光源是鹵鎢燈, 它所發(fā)出的復(fù)色光經(jīng)過透鏡和偏振片后, 擴展成一束平行偏振入射光; 核心分析單元由玻璃棱鏡(折射率n = 11516) 、金膜和樣品池組成, 整體固定在一個能精密調(diào)節(jié)入射光在棱鏡底部的入射角度的旋轉(zhuǎn)臺上; 金膜通過香柏油( n =1151)粘接在棱鏡底部, 鍍金面朝向樣品池, 金膜和樣品池體之間用密封墊密封. 信號檢測部分包括彩色CCD (WAT2231S,日本W(wǎng)atec公司) 、焦平面調(diào)節(jié)透鏡和圖像采集卡(OK_C30A, 北京嘉恒中自圖像技術(shù)有限公司). 圖像由微機記錄并顯示.

SPR儀器: 波長詢測SPR光譜儀也由本實驗室設(shè)計構(gòu)建.

1. 2實驗過程

成像實驗基本操作: 當(dāng)入射光從棱鏡的一側(cè)導(dǎo)入照射在棱鏡底部的金膜背面時, 調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)平臺, 使入射光滿足反射條件以形成共振吸收; 將待測樣品導(dǎo)入樣品池, 進而微調(diào)入射光角度, 使所記錄圖像最清晰. 把檢測到的圖像信號儲存,以待后續(xù)分析.

樣品測定: 將樣品溶液直接注入到樣品池中或使其流過金膜表面, 調(diào)節(jié)入射角, 實時記錄圖像.

微點陣樣品測定: 以BSA樣品為例敘述. (1) 將BSA溶解在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH =714)中, 配制成015 mg/mL溶液; (2) 在金膜表面自組裝一層MUA膜, 然后將其浸入NHS和EDC的混合液中, 使MUA末端的羧基活化; (3) 采用實驗室自制的點樣儀, 把BSA溶液直接點在經(jīng)修飾后的金膜表面上, 由于BSA末端氨基與金膜表面活化的酯基發(fā)生氨基偶聯(lián)反應(yīng)而形成鍵合微點陣;(4) 用鹽酸乙醇胺溶液浸泡傳感膜, 以封閉微點陣周圍背景處未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的酯基; (5) 依次用磷酸鹽緩沖溶液和水清洗傳感膜表面, 除去非鍵合吸附的BSA和乙醇胺, 最后用N2 氣吹干, 將其安裝在CSPR I儀上, 調(diào)節(jié)入射角, 實時記錄圖像.

SPR吸收光譜測定: 把金膜安裝在SPR光譜儀上, 調(diào)整入射角, 以空氣譜作參比光譜, 將樣品溶液泵入樣品池, 實時記錄SPR光譜.

2結(jié)果與討論

2. 1溶液的表面等離子體共振吸收彩色

利用CSPR I系統(tǒng)考察了一些純?nèi)芤簶悠返牟噬上? 圖2顯示的是水和乙醇在不同入射光角下測得的圖像色彩, 可見有非常明顯的區(qū)別. 該信號提示, 利用CSPR I技術(shù)可以根據(jù)顏色的不同和變化, 對樣品進行直觀的鑒別.

2. 2彩色成像分析

CSPR I圖像的色彩源于表面等離子體共振吸收, 對應(yīng)于吸收波長的互補色 .

圖3顯示了乙醇和水的SPR共振波長隨入射角的變化, 比較圖2和圖3可見, 隨著樣品的折射率和入射角的不同, 吸收波長會發(fā)生改變, 因而圖像的顏色會發(fā)生相應(yīng)的變化. 比如, 在入射角等于74. 86°時, 乙醇的吸收波長是658 nm, 故顯深綠色, 而水的吸收波長為603 nm, 故顯藍色. 又如當(dāng)入射角為77. 71°時, 乙醇和水的共振波長分別移至621 和583 nm, 其圖像色彩也相應(yīng)地變?yōu)榫G藍色和紫色.

2. 3蛋白點陣的彩色成像

通過溶液的彩色成像實驗可見, CSPR I可被用于樣品微點陣的彩色成像研究和顯示. 為此, 以BSA為對象進行了研究, 結(jié)果如圖4所示. 很明顯, 樣點與背景的顏色顯著不同, 由此可以非常直觀地判別出金膜上鍵合的蛋白樣點. 與水和乙醇的實驗類似, BSA點陣的色彩隨著入射角的改變而變化. 結(jié)果表明, CSPR I不僅可用于各種溶液的成像研究, 也可用于樣品點陣的直觀鑒別研究. 如果結(jié)合分子識別探針陣列, 有可能將CSPR I開發(fā)成一種全新的彩色圖像分析方法, 成為一種類似于DNA芯片的彩色分析新方法. 對此有待深入研究.