描述

項(xiàng)目概況

復(fù)雜群落中細(xì)胞之間的相互作用會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)超出簡(jiǎn)單細(xì)胞單一培養(yǎng)所能達(dá)到的意想不到的功能行為。在利用細(xì)胞群落推進(jìn)一系列合成生物學(xué)應(yīng)用（從生物材料到更高效的細(xì)胞工廠）方面存在巨大的未開(kāi)發(fā)潛力。我們正在構(gòu)建一個(gè)工具包，用于系統(tǒng)地設(shè)計(jì)兩種細(xì)胞類型的混合種群之間可能發(fā)生的結(jié)構(gòu)和生態(tài)相互作用。我們的工具包將提供兩種人工表面受體，用于構(gòu)建大腸桿菌之間粘附相互作用的組合以及用于在細(xì)胞之間產(chǎn)生協(xié)同和對(duì)抗生態(tài)關(guān)系的模塊化電路。借助這組相互兼容且具有功能特征的部件，我們將為科學(xué)家、教育工作者和基于社區(qū)的實(shí)驗(yàn)室提供開(kāi)放且可訪問(wèn)的資源，以開(kāi)始對(duì)多細(xì)胞細(xì)菌群落進(jìn)行編程。

生物積木

為了設(shè)計(jì)具有明確相互作用的細(xì)菌系統(tǒng)，我們利用了 3 個(gè)主要的生物“構(gòu)建塊”。這些是 1) 編碼蛋白質(zhì)的合成基因，這些蛋白質(zhì)允許細(xì)胞選擇性地識(shí)別和結(jié)合其他細(xì)胞（稱為“納米抗體”），2）不能自行產(chǎn)生某些必需營(yíng)養(yǎng)素的基因突變細(xì)菌菌株（稱為“營(yíng)養(yǎng)缺陷型”）， 3) 稱為質(zhì)粒的便攜式 DNA 元件，可產(chǎn)生抗菌毒素并對(duì)這些毒素產(chǎn)生選擇性免疫。

納米抗體粘附受體

我們有幾種用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌株，這些質(zhì)粒編碼納米抗體-抗原對(duì)。這些納米抗體蛋白在已用適當(dāng)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞表面表達(dá)。其他細(xì)菌細(xì)胞如果用合適的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，它們的細(xì)胞表面會(huì)顯示抗原。

納米抗體將以高特異性和親和力結(jié)合特定的表面抗原，因此顯示互補(bǔ)納米抗體-抗原對(duì)的不同細(xì)胞將相互粘附并形成團(tuán)塊。這些細(xì)胞還標(biāo)記有不同的熒光蛋白，因此可以在顯微鏡下檢測(cè)分析新興結(jié)構(gòu)。

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營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體

我們有 8個(gè)大腸桿菌突變體，它們對(duì) 4 種不同的氨基酸（色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和異亮氨酸）呈營(yíng)養(yǎng)缺陷型，并帶有 eGFP 或 mCherry 標(biāo)記。

每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型將無(wú)法生長(zhǎng)，除非它所在的培養(yǎng)基補(bǔ)充了相關(guān)的氨基酸，并且這些營(yíng)養(yǎng)缺陷型的生長(zhǎng)可以通過(guò)它們的熒光（在顯微鏡下的讀板器中）或通過(guò)觀察濁度來(lái)檢測(cè)（在讀板器或分光光度計(jì)中）。

氨基酸會(huì)擴(kuò)散出大腸桿菌細(xì)胞，因此同一環(huán)境中的不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型可能能夠彼此共享資源，從而在沒(méi)有補(bǔ)充氨基酸的培養(yǎng)基中維持生長(zhǎng)。這可用于生成互惠交互對(duì)。

毒素-抗毒素系統(tǒng)

細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出可以分泌毒素的自然系統(tǒng)，毒素是用來(lái)殺死其他細(xì)胞的大分子。可以用編碼產(chǎn)生毒素-抗毒素對(duì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，從而賦予產(chǎn)生毒素的細(xì)菌對(duì)毒素的抗性。這些釋放到周圍介質(zhì)中的毒素會(huì)傷害沒(méi)有抗毒素的其他細(xì)菌，從而在細(xì)胞之間產(chǎn)生對(duì)抗性的社會(huì)相互作用。

結(jié)果（截至2019.10.30）

設(shè)置突變菌株的生長(zhǎng)條件

我們首先必須調(diào)整生長(zhǎng)條件，以便營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體大腸桿菌在我們的工具包中將無(wú)法自行增長(zhǎng)，除非媒體得到補(bǔ)充。在碳源有限的嚴(yán)格培養(yǎng)基配方上未能看到任何生長(zhǎng)后，我們?cè)谔砑?0.4% 葡萄糖的 M9 基本培養(yǎng)基中看到了合理的生長(zhǎng)。我們可以通過(guò)補(bǔ)充過(guò)量（即 100 ug/mL）各自的氨基酸來(lái)挽救蛋氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的生長(zhǎng)（圖 1A）。在補(bǔ)充和未補(bǔ)充的平板上，我們證實(shí)其他氨基酸不能替代我們的任何營(yíng)養(yǎng)缺陷型，并且觀察到的生長(zhǎng)不僅僅是來(lái)自污染（圖 1B）。為了觀察這些影響，我們必須接種相對(duì)少量的細(xì)菌 (<3 uL)。更高的接種量導(dǎo)致突變體在所有培養(yǎng)基條件下的非特異性生長(zhǎng)，

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建立營(yíng)養(yǎng)缺陷型共生培養(yǎng)物

在驗(yàn)證了我們的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的功能特性后，我們接下來(lái)將成對(duì)的菌株混合在一起，以確定在其他情況下無(wú)法存活的菌株在混合時(shí)是否可以通過(guò)互惠相互作用恢復(fù)彼此的生長(zhǎng)能力。我們發(fā)現(xiàn)這些實(shí)驗(yàn)對(duì)起始細(xì)胞數(shù)量、生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)入最小培養(yǎng)基共培養(yǎng)室的殘留以及每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的生存能力差異非常敏感。然而，我們能夠在某些營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)之間建立強(qiáng)烈的互惠互作，包括 - 蛋氨酸和 - 異亮氨酸對(duì)的生長(zhǎng)，以及 - 異亮氨酸和 - 異亮氨酸等相同背景的營(yíng)養(yǎng)缺陷型不生長(zhǎng)（圖 2）。

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不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體自身（綠色和橙色）和混合在一起（藍(lán)色）的生長(zhǎng)曲線

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測(cè)量基因組編碼的熒光標(biāo)簽

為了區(qū)分我們正在共同培養(yǎng)的菌株，我們選擇了在基因組中集成了不同熒光蛋白標(biāo)記的兼容菌株（mCherry 用于紅色熒光，eGFP 用于綠色熒光）。我們將這些菌株的載玻片和陰性對(duì)照（非熒光）和陽(yáng)性對(duì)照（已知熒光）細(xì)菌以不同密度放在落射熒光顯微鏡下。我們發(fā)現(xiàn)稀釋密度會(huì)導(dǎo)致分散的單細(xì)胞（與團(tuán)塊或堆疊相反）和視野中的大量細(xì)胞（與細(xì)胞太少無(wú)法分析的稀疏視圖相反）。校準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照的顯微鏡設(shè)置后，我們?cè)谒?eGFP 和 mCherry 標(biāo)記的菌株上看到了清晰的熒光信號(hào)。然而，我們也經(jīng)歷了極快的光漂白，信號(hào)在照明后幾秒鐘內(nèi)消失到無(wú)法檢測(cè)到的水平。盡管我們測(cè)試的幾種抗褪色封片劑都不能解決這個(gè)問(wèn)題，但我們能夠?qū)晒鈮勖娱L(zhǎng)數(shù)秒，足以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行仔細(xì)成像（圖 3）。

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我們細(xì)菌菌株的顯微鏡圖像

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驗(yàn)證納米體粘附菌株

我們建立了一個(gè)協(xié)議，用于將我們的粘附質(zhì)粒引入我們?cè)S多不同的標(biāo)記和營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌背景，而無(wú)需通常的細(xì)菌轉(zhuǎn)化第一步，即首先使細(xì)胞具有能力。我們基于電穿孔的方案在從眾多菌株中制造轉(zhuǎn)基因細(xì)菌方面節(jié)省了大量時(shí)間，并且具有避免使用冷藏離心機(jī)等設(shè)備和使用像我們這樣的許多社區(qū)實(shí)驗(yàn)室空間無(wú)法使用的快速冷凍的額外好處。

使用此協(xié)議，我們生成了帶有粘附質(zhì)粒和熒光標(biāo)簽的菌株，以及一小部分帶有粘附質(zhì)粒的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。在轉(zhuǎn)化之前，我們對(duì)所有粘附質(zhì)粒進(jìn)行了 Sanger 測(cè)序，以驗(yàn)證每個(gè)構(gòu)建體與預(yù)期序列完全匹配。這一點(diǎn)特別重要，因?yàn)橐恍╇闹挥?4 個(gè)氨基酸長(zhǎng)，否則很難檢測(cè)到錯(cuò)誤。

我們已經(jīng)開(kāi)始測(cè)試用于編程物理交互的一組表面展示的納米抗體和抗原對(duì)。通過(guò)簡(jiǎn)單的結(jié)塊測(cè)定，我們可以觀察到細(xì)菌與結(jié)合的納米抗體-抗原組混合的培養(yǎng)物的濁度略有變化，這是由于結(jié)合細(xì)胞聚集成可以沉淀的致密團(tuán)塊。我們已經(jīng)看到了三個(gè)粘附對(duì)中的一個(gè)的令人鼓舞的初步結(jié)果（圖 4A）。在納米抗體表達(dá)細(xì)胞和成對(duì)的抗原表達(dá)細(xì)胞的混合物的三個(gè)重復(fù)中的兩個(gè)，在第一個(gè)小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)了顯著的結(jié)塊，而沒(méi)有納米抗體匹配的對(duì)照沒(méi)有顯著結(jié)合（圖 4B）。

具有誘導(dǎo)的納米抗體相互作用的細(xì)胞聚集

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與毒素/抗毒素系統(tǒng)的拮抗相互作用

我們還設(shè)計(jì)了一種質(zhì)粒，用于產(chǎn)生分泌毒素的細(xì)菌，它們自身通過(guò)抗毒素的內(nèi)部表達(dá)對(duì)其免疫（圖 5）。我們?yōu)檫@種毒素-抗毒素質(zhì)粒選擇了大腸桿菌素 E1，并在可誘導(dǎo)的阿拉伯糖啟動(dòng)子的調(diào)控下能夠滴定毒素水平，從而可以發(fā)生有趣的生態(tài)相互作用，例如 amensalism，而不會(huì)強(qiáng)到?jīng)]有抗毒素的細(xì)胞不能成長(zhǎng)和互動(dòng)。到目前為止，我們已經(jīng)提取了最終質(zhì)粒組裝所需的一半部分，并將使用我們已建立的生長(zhǎng)測(cè)定法克隆和測(cè)試質(zhì)粒。

毒素-抗毒素表達(dá)質(zhì)粒示意圖

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顯微鏡下的共培養(yǎng)表型

在我們準(zhǔn)備和驗(yàn)證了大部分基礎(chǔ)菌株后，我們開(kāi)始描述相互作用細(xì)胞的共培養(yǎng)物如何在微觀水平上出現(xiàn)。作為第一個(gè)例子，我們采用相互依賴的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體，讓它們一起建立穩(wěn)定的生長(zhǎng)。一個(gè)突變體我們標(biāo)記為綠色 (eGFP)，另一個(gè)標(biāo)記為紅色 (mCherry)。將細(xì)胞從我們的培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移到顯微鏡載玻片上后，我們可以在廣角熒光顯微鏡下觀察不同的細(xì)胞群（圖 6A）。可以從我們的共培養(yǎng)圖像中提取大量表型，例如細(xì)胞鄰近性、比率和定位（圖 6B）。雖然我們還沒(méi)有開(kāi)始全面探索這些對(duì)我們成像數(shù)據(jù)的潛在分析，但我們打算研究量化共培養(yǎng)圖像的方法。

營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌的共培養(yǎng)

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如何使用我們的微生物工具包

對(duì)于有興趣嘗試我們的工具包的最終用戶，我們?cè)诖颂幪峁┝艘粋€(gè)示例來(lái)說(shuō)明該工具包的工作原理以及我們提供的相應(yīng)協(xié)議和資源。在其最終形式中，用戶將收到我們?yōu)楣ぞ甙械拿糠N大腸桿菌菌株準(zhǔn)備的冷凍甘油原液等分試樣。這些菌株包括具有營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變、誘導(dǎo)毒素/抗毒素質(zhì)粒以及表面展示的納米抗體和抗原的不同組合的細(xì)菌。每個(gè)菌株在其基因組中都有一個(gè)綠色或紅色熒光標(biāo)記，以便在實(shí)驗(yàn)中輕松識(shí)別。

通過(guò)將兩種菌株混合在一起，用戶可以建立一個(gè)明確的雙細(xì)胞類型群落。我們的協(xié)議涵蓋了將細(xì)菌種群培養(yǎng)成培養(yǎng)物所需的所有基本必要信息，以及在微量滴定板上混合菌株以進(jìn)行基于平板的實(shí)驗(yàn)的方法。遵循這些協(xié)議，即使對(duì)于營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體，我們也能夠可靠地獲得適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)行為。重要的是，這些準(zhǔn)則允許觀察到互利共生的相互作用。

還提供了使用我們的表面粘附蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞聚集的方案。一旦我們的毒素/抗毒素系統(tǒng)完成，我們還將獲得校準(zhǔn)誘導(dǎo)水平以獲得穩(wěn)定的拮抗相互作用的說(shuō)明。我們還有一個(gè)使用熒光標(biāo)簽監(jiān)測(cè)共培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)的程序，這對(duì)生態(tài)相互作用特別有用。用于分析增長(zhǎng)數(shù)據(jù)的 Python 代碼與我們的協(xié)議一起提供。

這些協(xié)議中的任何一個(gè)都可以用來(lái)單獨(dú)描述給定的共文化。我們還有準(zhǔn)備細(xì)胞樣本以在顯微鏡下觀察的方案，我們希望這將成為用戶在微生物群落復(fù)雜性不斷增加的水平上進(jìn)行探索的特別有趣的觀察來(lái)源。

外表

我們希望盡快完成組裝構(gòu)成我們交互工具箱的粘附菌株和突變菌株。我們正在努力優(yōu)化的協(xié)議將是該工具包的另一個(gè)關(guān)鍵組成部分，因此其他人可以輕松建立適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件來(lái)觀察有趣的生物學(xué)效應(yīng)。

我們的工具包有許多潛在的應(yīng)用。首先，它可能會(huì)用作一種教育資源，以通過(guò)易于查看的讀數(shù)顯示簡(jiǎn)單設(shè)置中的微生物相互作用。其次，它們可以成為在還原論框架下研究微生物相互作用的研究工具。復(fù)雜細(xì)胞自組裝的可能性特別有趣，并且有來(lái)自其他人的數(shù)據(jù)支持其合理性。第三，混合細(xì)胞群之間的穩(wěn)定相互作用可用于優(yōu)化生物反應(yīng)器，超出單一培養(yǎng)所能達(dá)到的范圍。最后，能夠?qū)@些相互作用進(jìn)行編程可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛糜谏a(chǎn)圖案化生物材料的支架。通過(guò)我們作為 Biomaker Challenge 的一部分的工作以及我們作為劍橋大學(xué)合成生物學(xué)協(xié)會(huì)的學(xué)生的項(xiàng)目，

參考

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Marchal M、Goldschmidt F、Derksen-müller SN、Panke S、Ackermann M、Johnson DR。被動(dòng)的共生相互作用促進(jìn)了微生物種群內(nèi)空間結(jié)構(gòu)的進(jìn)化。BMC 進(jìn)化生物學(xué)。2017；17(1)：106。

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