自2019年12月以來, 全球流行的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）已感染過億人，并導致了近2500萬人死亡?，F(xiàn)在全球報告的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）病例數(shù)已經(jīng)連續(xù)五周下降，表明即使存在病毒變體，簡單的公共衛(wèi)生措施（大規(guī)模篩查和主動隔離）仍能發(fā)揮作用。對于大規(guī)模篩查而言，需要高靈敏、高通量和低成本的檢測方法以識別感染者和追蹤潛在感染者，改善局部控制能力，并為區(qū)域疾病控制工作提供依據(jù)。RT-qPCR方法是COVID-19診斷的金標準方法，卻受限于訓練有素的人員和昂貴的儀器需求，而無法在欠發(fā)達國家和地區(qū)廣泛應用。因此亟需快速、靈敏、無需專業(yè)人員操作和復雜設備的COVID-19高通量測試方法以擴展COVID-19的診斷能力。

近來，美國杜蘭大學醫(yī)學院分子診斷中心的胡曄教授和寧波教授報道了一種基于CRISRP技術的超靈敏、高通量COVID-19熒光診斷系統(tǒng)（CRISPR-FDS, CRISPR-based fluorescent detection system)。相關研究以“Ultra-sensitive and high-throughput CRISPR-powered COVID-19 diagnosis”為題發(fā)表在國際權威期刊雜志《Biosensors and Bioelectronics》上（DOI:10.1016/j.bios.2020.112316）。南昌大學博士研究生黃震為該論文的第一作者。

研究的主要內(nèi)容介紹

CRISPR-FDS利用一步RT-PCR技術擴增從樣品提取的病毒RNA目標片段（ORF1ab 和N基因），將所得的擴增子整體轉(zhuǎn)移至基于gRNA/Cas12a的CRISPR系統(tǒng)中進行熒光檢測。目標特異性的gRNA將引導Cas12a蛋白特異性切割目標基因，同時非特異性切割單鏈熒光探針以釋放熒光信號。該方法也兼容RPA等恒溫擴增技術，可將檢測時間縮短至50分鐘。CRISRP-FDS于其他非SARS-CoV-2病原體無交叉，且檢測限低至2 拷貝/反應，較RT-qPCR優(yōu)勢明顯。且與臨床實驗室進行RT-qPCR測試相比，針對同樣的COVID-19疑似病例鼻拭子樣本進行測試，CRISRP-FDS方法表現(xiàn)出更高的靈敏度和穩(wěn)定性。

CRISPR-FDS 診斷流程。該方法兼容拭子，唾液和血液等多種標本，即可應用于大規(guī)模篩查，也可實現(xiàn)POCT檢測，且具有極大的臨床應用潛力。

值得注意的是，CRISPR-FDS采用了大多數(shù)臨床實驗室中容易獲得的試劑和設備，可以很容易地實現(xiàn)自動化，以滿足對高通量測試的需求。而且，胡教授團隊進一步整合CRISPR-FDS技術和微流控芯片技術，實現(xiàn)了基于智能手機讀取的唾液POCT測試（Science advances, DOI: 10.1126/sciadv.abe3703）以提升欠發(fā)達地區(qū)的測試能力。另外，胡教授團隊基于CRISPR-FDS技術定量追蹤感染者血液中的病毒RNA，臨床研究表明該技術可以改善COVID-19診斷，用于SARS-CoV-2感染清除的評估，并預測感染的嚴重程度（Journal of Clinical Investigation, DOI: 10.1172/JCI146031）。

小結

CRISPR-FDS具有超高的靈敏度和特異性，簡單，穩(wěn)定且無需昂貴的儀器，適用于COVID-19的大規(guī)模篩查?；谠摷夹g的唾液POCT測試可以進一步擴展其應用場景，提升欠發(fā)達地區(qū)的檢測能力。而且臨床驗證已經(jīng)表明，CRISPR-FDS具有重大的臨床應用價值以評估SARS-CoV-2的清除和預測疾病嚴重程度。

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