新冠病毒肺炎（COVID-19）抗原檢測的主要生物標(biāo)記物是尖峰蛋白（S）和核衣殼蛋白（N），S蛋白包含兩個亞基——S1和S2。S1蛋白包含一個獨特的受體結(jié)合域（SRBD），可與人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）特異性相互作用，進(jìn)一步介導(dǎo)宿主細(xì)胞識別。SRBD是開發(fā)新冠病毒特異性識別傳感探針的理想目標(biāo)。N蛋白是新冠病毒最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，并且它顯示出很強的免疫原性，通常作為COVID-19檢測的生物標(biāo)志物。

圖1 新型冠狀病毒結(jié)構(gòu)

近日，期刊Chemical Communications在線刊登蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所張連軍研究團隊聯(lián)合瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院王京研究團隊的研究成果（Rapid and sensitive multiplex detection of COVID-19 antigens and antibody using electrochemical immunosensor-/aptasensor-enabled biochips），詳細(xì)介紹了一種基于電化學(xué)傳感器的生物芯片，可對COVID-19抗原和抗體進(jìn)行快速、靈敏的多重檢測。

圖2（a）所示為基于電化學(xué)傳感器的生物芯片渲染圖，其中包含多個獨立的傳感器。根據(jù)工作電極上包被生物標(biāo)記物的不同，傳感器分為電化學(xué)免疫傳感器（electrochemical immunosensor）和電化學(xué)核酸適配體傳感器在（electrochemical aptasensor）。

對于電化學(xué)免疫傳感器，選擇新冠病毒S1-IgG抗體和S1蛋白作為傳感器識別元件，分別識別拭子樣本中的S1蛋白和血液樣本中的S1-IgG抗體。

對于電化學(xué)核酸適配體傳感器，通過SELEX方法篩選的兩個S1蛋白特異性核酸適配體（RBD-Ap-1、RBD-Ap-2）和一個N蛋白特異性核酸適配體（N-Ap），將其固定在傳感器上，以捕獲S1蛋白和N蛋白。

圖2 （a）可多重檢測新冠病毒S蛋白、N蛋白及IgG抗體的電化學(xué)生物傳感器陣列方案；（b）ELISA評估核酸適配體與新冠靶抗原的結(jié)合時間、最小自由能二級結(jié)構(gòu)和核酸適配體的解離常數(shù)（Kd）；（c）核酸適配體的交叉反應(yīng)性驗證。

為了制備電化學(xué)免疫傳感器，研究人員將S1-IgG抗體和S1蛋白共價固定在金納米顆粒絲網(wǎng)印刷電極（AuNP-SPE）表面，并進(jìn)行一系列的表面修飾，具體步驟如下：

（1）在工作電極上滴加20μl 10mM半胱胺（巰基乙胺，cysteamine）溶液以引入-NH?基團，孵育2小時后，使用PBS-T緩沖液（0.05% Tween20溶于1 × PBS溶液中，pH=7.4）進(jìn)行表面清洗；

（2）將20μl 2.5%戊二醛（在PBS-T緩沖液中制備）溶液滴加到工作電極表面，孵育15分鐘后，使用PBS-T溶液清洗；

（3）將20μl 50μg/ml新冠病毒特異性生物標(biāo)記物（S1-lgG或S1蛋白，在PBS-T中制備）滴加在工作電極表面，孵育2小時以進(jìn)行席夫堿（Schiff base）反應(yīng)，然后用PBS-T緩沖液進(jìn)行表面清洗。再將20μl 0.5 M乙醇胺（2-羥基乙胺，2-Aminoethanol）溶液滴加在工作電極表面，孵育15分鐘后，用PBS-T緩沖液進(jìn)行表面清洗，用乙醇胺的-NH?滅活未反應(yīng)的-CHO；

（4）將20μl 1%BSA溶液（在PBS-T緩沖液中制備）滴加到工作電極表面，孵育15分鐘后，使用PBS-T緩沖液清洗；

（5）制備的電化學(xué)免疫傳感器用氮氣干燥，封口膜密封，-20°C避光儲存。

圖3 電化學(xué)免疫傳感器表面修飾步驟示意圖

為了制備電化學(xué)核酸適配體傳感器，研究人員將COVID-19抗原特異性單鏈DNA核酸適配體（ssDNA aptamer）探針共價固定在金納米顆粒絲網(wǎng)印刷電極（AuNP-SPE）表面，并進(jìn)行一系列的表面修飾，具體步驟如下：

（1）將75μl 1μM硫醇化ssDNA aptamer探針與2μl 5mM TCEP（硫醇類還原劑）混合，在室溫下孵育60分鐘以減少二硫鍵；

（2）在工作電極上滴加20μl 1μmol核酸適配體探針溶液，然后避光孵育2h以固定探針；

（3）用PBS緩沖液清洗電極，然后在工作電極上滴加20μl 2mM新鮮制備的MCH溶液，室溫下避光孵育2h，然后用去離子水清洗；

（4）制備的電化學(xué)核酸適配體傳感器用氮氣干燥，封口膜密封，-20°C避光儲存。

圖4 電化學(xué)核酸適配體傳感器表面修飾步驟示意圖

圖5 核酸適配體（探針）的序列

總體而言，該研究工作中基于電化學(xué)傳感器的生物芯片在COVID-19檢測方面表現(xiàn)出較為優(yōu)異的性能，例如：更低的檢測限、更廣的檢測范圍、更高的靈敏度、較短的響應(yīng)時間及較好的選擇性等等，有望成為COVID-19檢測（家庭自檢、社區(qū)快速診斷）的一把“利器”。

圖6 COVID-19檢測方法匯總及檢測性能比較

論文鏈接：

https://doi.org/10.1039/D2CC01598F

審核編輯 ：李倩