大多數(shù)體內(nèi)組織細(xì)胞存在于三維細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中。為了更好地研究細(xì)胞生理學(xué)和病理生理學(xué)，越來越需要類似于體內(nèi)的微環(huán)境以培養(yǎng)細(xì)胞，目前正在研究的策略包括水凝膠、球體、組織支架和非常有前景的微流控系統(tǒng)。

近期，大連理工大學(xué)的李經(jīng)民課題組，提出了一種3D打印支架集成的“三明治”結(jié)構(gòu)微流控裝置，用于三維動態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，該微流控裝置具有良好的生物相容性和可行性，在體外細(xì)胞研究、組織工程和腫瘤治療藥物篩選方面具有巨大的潛力。相關(guān)研究以 “Engineering a dynamic three-dimensional cell culturing microenvironment using a ‘sandwich’ structure-liked microfluidic device with 3D printing scaffold”為題發(fā)表在Biofabrication期刊上。

在二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，細(xì)胞生長在平板上，難以模擬體內(nèi)復(fù)雜的三維微環(huán)境。近幾十年來，微流控技術(shù)被廣泛采用，以提供簡單、有效的3D空間來加速細(xì)胞聚集并指導(dǎo)細(xì)胞球體的形成，可用于3D動態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)?；诖?，李經(jīng)民課題組提出了一種模擬細(xì)胞外基質(zhì)和微循環(huán)的體外三維培養(yǎng)模型的建立方法。使用熱輔助電液動力噴射（TAEJ）打印技術(shù)設(shè)計的3D微流控裝置具有“三明治”狀夾層結(jié)構(gòu)，包括上層、支架層和底層。用其進行HeLa細(xì)胞的三維培養(yǎng)，并與48孔板和無支架裝置中的二維培養(yǎng)細(xì)胞進行比較。

“三明治”式微流控裝置的設(shè)計

活體細(xì)胞存在于復(fù)雜的三維微環(huán)境中，其中存在諸如可溶性因子、細(xì)胞-細(xì)胞接觸、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和流體流動引起的剪應(yīng)力等因素（圖1a）。受體內(nèi)細(xì)胞三維微環(huán)境的啟發(fā)，該研究設(shè)計了一種能夠為細(xì)胞培養(yǎng)提供三維組織支架和動態(tài)液的夾心式微流控裝置。該裝置由三層組成，即上層、支架層和底層（圖1b）。圖1c顯示了微流控裝置和不同上下層結(jié)構(gòu)的相應(yīng)位置。

圖1 微流控裝置的設(shè)計

微流控裝置的制作

微流控裝置的上層和底層是用聚二甲基硅氧烷（PDMS）通過復(fù)制母片上的結(jié)構(gòu)來制造的（圖2a）。支架層利用PCL/PVP復(fù)合生物聚合物墨水并采用TAEJ印刷技術(shù)制造（圖2b）。最后，使用氧等離子體處理整個裝置（圖2c），進行不可逆地粘合。

圖2 微流控裝置的制造工藝示意圖

微流控裝置的結(jié)構(gòu)

圖3a顯示了用于打印3D PCL/PVP支架的設(shè)備。圖3b可見3D打印支架的掃描電子顯微鏡圖像，該支架的支架纖維平均寬度約為12微米，相鄰纖維之間的平均距離約為70微米。圖3c為支架的三維輪廓，呈現(xiàn)出均勻而光滑的特征。圖3d為PDMS上層的斷面圖像，內(nèi)部微柱為上板的凸起，凸起的高度為50微米。圖3e是底部PDMS層的截面圖像，小室的深度等于外部微柱的高度，即200微米。圖3f是粘合裝置的截面圖像，可防止因流體流動而產(chǎn)生的變形沖刷，提高了支架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。圖3g是用于粘合三層的設(shè)備。經(jīng)氧等離子體處理后，將一片PDMS放在上板的下表面，另一片放在底板的上表面，并在范德華力的作用下可逆結(jié)合。然后，通過調(diào)整，將兩個PDMS塊在Z方向上對齊。最后，將兩個PDMS片不可逆地粘合在一起（圖3h）。圖3i可見粘合的裝置充滿了紅色墨水，表明裝置內(nèi)的流動狀況良好。

圖3 微流控裝置的設(shè)備和結(jié)構(gòu) 支架對裝置內(nèi)流場的影響

為了研究3D打印支架對裝置內(nèi)流場條件的影響，定性上，通過比較顏色的漸變，可以觀察到控制室（圖4a）中的流速明顯快于支架區(qū)域 （圖4b）。圖4c顯示了沿交叉線的速度曲線，這些拋物線狀曲線表明，室內(nèi)的流場分布明顯不均勻。相反，支架區(qū)域的流場分布更均勻，交叉線的曲線相對平滑（圖4d）。在圖4e-f中，藍(lán)色軌跡的長度表明控制室的平均速度比支架區(qū)域的平均速度快。圖4g顯示了不同設(shè)備中平均跟蹤粒子速度的小提琴曲線圖。紅點和藍(lán)點表示速度樣本的中位數(shù)，可見紅色小提琴區(qū)（無支架裝置）的高度大于藍(lán)色（有支架裝置）的高度，前者的速度分布更分散，說明支架可以為細(xì)胞培養(yǎng)提供更均勻的流動微環(huán)境。

圖4 微流控裝置內(nèi)的流場狀況及3D打印支架對其流場的影響

墨水流動模擬細(xì)胞培養(yǎng)過程

為了展示細(xì)胞培養(yǎng)過程，研究了不同顏色油墨的流動行為。首先，在引入HeLa細(xì)胞懸液（藍(lán)色墨水）之前，在裝置中裝滿培養(yǎng)液（紅色墨水）以去除氣體。用塞子堵住細(xì)胞入口和細(xì)胞出口，通過將培養(yǎng)液入口連接到注射器泵上，將培養(yǎng)液注入設(shè)備（圖5a）。輸注20s后，將細(xì)胞懸液（藍(lán)色墨水）注入裝置，多余的細(xì)胞懸液從細(xì)胞出口溢出。培養(yǎng)液入口和出口用塞子堵塞（圖5b）。結(jié)果表明，輸入20s后，培養(yǎng)室內(nèi)充滿藍(lán)色墨水。靜置6h后，將培養(yǎng)液輸入，細(xì)胞入口和細(xì)胞出口被堵塞（圖5c）?？梢姽嘌b500s后，該裝置充滿了紅墨水，表明培養(yǎng)室內(nèi)裝滿了培養(yǎng)液，廢液從培養(yǎng)液出口流出。

圖5 Exo-TDN的肝臟保護作用研究 在裝置和平板中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞

在3D打印支架的微流控裝置中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，研究其生物相容性和可行性。圖6a-c分別顯示了引入微流控裝置和平板中的HeLa細(xì)胞的初始狀態(tài)。6d-f分別顯示了HeLa細(xì)胞在微流控裝置內(nèi)和平板內(nèi)培養(yǎng)72h的狀態(tài)?？梢?，在有支架的小室中，HeLa細(xì)胞在明場上的觀察受到了干擾。因此需結(jié)合活/死（綠/紅）染料染色，以進一步估計細(xì)胞密度（圖6g-i）。這些熒光圖像中細(xì)胞亮度的變化可能表明HeLa細(xì)胞在不同的深度附著在支架上。圖6j-l分別顯示了HeLa細(xì)胞在有支架裝置、無支架裝置和48孔板中的空間分布重建。相應(yīng)地，3D重建的X-Z截面如圖6m-o所示，以表征細(xì)胞在高度（Z軸）方向上的分布。可以明顯觀察到，支架裝置的細(xì)胞三維重建高度明顯大于對照組。圖6p顯示帶有支架的裝置中的細(xì)胞密度顯著大于對照裝置和平板中的細(xì)胞密度。表明，三維動態(tài)培養(yǎng)模型在促進細(xì)胞生長方面具有優(yōu)勢。根據(jù)活/死染色結(jié)果計算活細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比，評價HeLa細(xì)胞的存活率。如圖6q所示，平板和對照裝置中的細(xì)胞存活率為86.7%和90.8%，而支架微流控裝置細(xì)胞存活率為95.3%，優(yōu)于對照組。圖6r顯示了培養(yǎng)72h后，有支架微流控裝置的細(xì)胞縱橫比中位數(shù)約為3.2，是平板和無支架裝置的1.5倍以上。結(jié)果表明，支架可以促進細(xì)長和紡錘形的HeLa細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生。

圖6 HeLa細(xì)胞生長在微流控裝置和平板內(nèi)

微流控裝置和平板中DOX的細(xì)胞毒性評價

實驗結(jié)果表明，在不同濃度的DOX作用下，支架組的細(xì)胞存活率始終高于對照組，且細(xì)胞存活率隨DOX濃度的增加而降低。較高濃度的DOX對HeLa細(xì)胞存活率的影響較低濃度的細(xì)胞更為顯著，除了藥物傳遞效率低下外，3D支架中形成的體內(nèi)類微環(huán)境可能在耐藥中發(fā)揮重要作用，因為較高的細(xì)胞密度限制了DOX對3D類組織結(jié)構(gòu)的滲透。此外，從熒光圖像中可以明顯地觀察到DOX作用24h后細(xì)胞形態(tài)的變化，支架裝置的細(xì)胞長寬比中位數(shù)仍然高于其他組，意味著治療后細(xì)胞的去極化行為也表現(xiàn)出對DOX的劑量依賴性反應(yīng)，與細(xì)胞活力是一致。以上結(jié)果表明，具有支架的微流控裝置，為體外細(xì)胞研究、組織工程和腫瘤治療藥物篩選提供自然的微環(huán)境（圖7）。

圖7 微流控裝置和平板中的HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度的DOX處理24h后的細(xì)胞毒性研究

綜上所述， 研制了一種“三明治”結(jié)構(gòu)的微流控裝置，用于在有流體流動的三維微環(huán)境中進行動態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)。該裝置由三層組成，上層用于引入細(xì)胞和固定支架，中間層模仿細(xì)胞外基質(zhì)提供3D附著區(qū)，底層模仿血管為細(xì)胞提供動態(tài)培養(yǎng)液。利用3D打印技術(shù)和微細(xì)加工技術(shù)成功地制作了該器件。該支架可以為細(xì)胞培養(yǎng)提供更穩(wěn)定的流體微環(huán)境，具有良好的流動性，促進了細(xì)胞的生長和活力。DOX的體外細(xì)胞毒性評估證實，采用3D支架模擬體內(nèi)微環(huán)境的裝置具有更高的耐藥性?？蔀轶w外細(xì)胞研究、組織工程和腫瘤治療藥物篩選提供良好的微環(huán)境。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1088/1758-5090/ac8a19

審核編輯 ：李倩