作者：郝翔， 李依明， 傅爽， 李旸暉， 許迎科， 匡翠方， 劉旭

20世紀(jì)90年代以來(lái)，科技的進(jìn)步突破了光學(xué)顯微鏡的衍射極限，使三維超分辨顯微成像技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。其中，基于兩個(gè)對(duì)置物鏡的4Pi顯微架構(gòu)及其超分辨版本的出現(xiàn)是一個(gè)重要的里程碑，并在材料科學(xué)領(lǐng)域和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

中國(guó)工程院院刊《Engineering》2022年第4期刊發(fā)浙江大學(xué)郝翔教授研究團(tuán)隊(duì)的《4Pi熒光超分辨顯微術(shù)綜述》一文，綜述了4Pi超分辨顯微術(shù)的近期進(jìn)展。文章指出，4Pi超分辨顯微鏡為透明樣品觀測(cè)提供了一種能夠突破衍射極限、非侵入、各向同性的三維分辨率的技術(shù)手段。針對(duì)目標(biāo)開(kāi)關(guān)和隨機(jī)開(kāi)關(guān)兩個(gè)主要的4Pi超分辨顯微術(shù)版本，文章深入討論了其架構(gòu)、原理、應(yīng)用和未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。

一、引言

自1873年Abbe等推導(dǎo)出衍射極限以來(lái)，光學(xué)顯微鏡的分辨率在接下來(lái)的一個(gè)多世紀(jì)中未能取得根本性突破。然而，對(duì)于高分辨率的追求從來(lái)就沒(méi)有停止。最終，經(jīng)過(guò)不懈努力，科學(xué)家在20世紀(jì)90年代取得突破。由于衍射極限的存在，可見(jiàn)光波段范圍內(nèi)的顯微鏡分辨率一直被限制在250 nm以?xún)?nèi)。超分辨顯微術(shù)的出現(xiàn)使得人類(lèi)終于打破這一桎梏。得益于過(guò)去20年超分辨顯微術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)階段已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)在xy平面和沿z軸將分辨率分別提升6~10倍。需要強(qiáng)調(diào)的是，超分辨顯微術(shù)并非特指某項(xiàng)技術(shù)，而是若干種不同技術(shù)方案的總稱(chēng)。但是，無(wú)論具體實(shí)現(xiàn)方式如何，這些技術(shù)在本質(zhì)上是相通的：各種技術(shù)都由光強(qiáng)調(diào)制，并且非線(xiàn)性地開(kāi)關(guān)熒光染料分子以實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光輻射的操控，繼而在時(shí)間上依次記錄整個(gè)觀察區(qū)域內(nèi)的細(xì)節(jié)。正是由于這些技術(shù)能夠提供突破衍射極限的分辨率，才使首次使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行許多生命科學(xué)研究成為可能。

由于大部分生物結(jié)構(gòu)都具備三維空間分布，因此，將超分辨率成像擴(kuò)展至三維水平，可以清晰地顯示這些生物體結(jié)構(gòu)或記錄分子運(yùn)動(dòng)。將原有的二維超分辨顯微成像擴(kuò)展至三維水平有多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)路徑。對(duì)于單分子定位顯微術(shù)（SMLM），如光激活定位顯微術(shù)（PALM）、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)、熒光激活定位顯微術(shù)（fPALM）而言，可以采用雙焦面成像或者點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）操控的方法；對(duì)于以受激發(fā)射損耗顯微術(shù)（STED）、可逆飽和光學(xué)熒光躍遷顯微術(shù)為代表的目標(biāo)開(kāi)關(guān)超分辨顯微術(shù)而言，最常用的策略則是同時(shí)使用兩個(gè)相位板，通過(guò)非相干疊加的方式來(lái)創(chuàng)造一個(gè)三維中空的STED/RESOLFT聚焦光斑。

通過(guò)以上兩種技術(shù)路徑都可以在理論上獲得無(wú)限小的分辨率。然而，在這些不受衍射極限限制的技術(shù)中，光的衍射現(xiàn)象實(shí)質(zhì)上仍然發(fā)揮作用。然而，無(wú)論使用哪種技術(shù)，最終能達(dá)的分辨率仍然取決于顯微鏡聚焦光斑的銳利程度。這一事實(shí)導(dǎo)致的后果便是：相對(duì)而言，軸向分辨率的提高比橫向（焦平面內(nèi)）分辨率的提高更加困難。因此，即使通過(guò)超分辨顯微術(shù)可以將橫向分辨率提升到20~40 nm，但是同一架構(gòu)下達(dá)到的軸向分辨率仍然比橫向分辨率低（后者約是前者的2.5倍）。

相對(duì)而言，各向同性的三維分辨率受到更多青睞；因?yàn)楦飨蛲缘娜S分辨率能夠提供更加自然的視野，并且基于這樣的圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到的結(jié)果也更加精確。然而，由于使用單個(gè)透鏡只能覆蓋半個(gè)球面波波前，除非刻意犧牲橫向分辨率，否則要做到三維各向同性是非常困難的。另外，如果存在一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，能夠收集焦面之后的另外半個(gè)球面波波前，由于對(duì)稱(chēng)性的恢復(fù)，系統(tǒng)PSF的形狀就可以（基本上）保持為一個(gè)球形?；谏鲜鏊枷?，在20世紀(jì)90年代早期，Hell等發(fā)明了基于兩個(gè)對(duì)置物鏡的4Pi顯微鏡。在實(shí)際應(yīng)用中，一個(gè)物鏡大約只可以覆蓋65°的半孔徑角，使用兩個(gè)物鏡則可以幾乎完整覆蓋整個(gè)4 π的立體角（實(shí)際應(yīng)該為2.5 π~3 π）。如圖1所示，在4Pi顯微術(shù)中，逆向傳播的兩束相干照明光分別經(jīng)過(guò)兩個(gè)對(duì)置物鏡在共焦面上聚焦，并產(chǎn)生疊加干涉條紋的PSF。這種實(shí)現(xiàn)方式被稱(chēng)為A型4Pi架構(gòu)。另一種實(shí)現(xiàn)方式，即B型4Pi架構(gòu)，則通過(guò)對(duì)置物鏡反向收集熒光信號(hào)并讓它們?cè)?a target="_blank">探測(cè)器上發(fā)生干涉。由于引入了共焦面附近的干涉，上述兩種方式都可以在軸向上顯著壓縮PSF的尺寸——這也是構(gòu)成掃描型4Pi顯微鏡的基礎(chǔ)。如果只保證激發(fā)光（A型4Pi架構(gòu)）或熒光（B型4Pi架構(gòu)）相干，則可以將軸向分辨率提高3~4倍。如果同時(shí)使激發(fā)光和熒光相干（C型4Pi架構(gòu)），則可以將軸向分辨率提高約7倍。除此之外，由于4Pi架構(gòu)可以從兩個(gè)方向收集熒光，可收集的熒光光子數(shù)可翻倍，最終可以提高圖像的信噪比（SNR）。與之類(lèi)似，非相干干涉照明圖像干涉顯微術(shù)可以被理解為是4Pi顯微術(shù)基于相機(jī)的寬視場(chǎng)版本：包含兩個(gè)對(duì)置物鏡，在焦面附近采用駐波干涉作為照明，并以相干的方式收集熒光信號(hào)。因此，它的分辨率也與4Pi顯微鏡類(lèi)似。

圖1. 4Pi顯微鏡的簡(jiǎn)化架構(gòu)與原理示意圖。（a）簡(jiǎn)化架構(gòu)示意圖。（b）在軸向平面（xz平面）內(nèi)的4Pi顯微鏡PSF。上下兩個(gè)物鏡的PSF相干疊加壓縮了整個(gè)PSF的軸向尺寸。（c）不同4Pi架構(gòu)的有效PSF。從左至右：A型架構(gòu)，激發(fā)光相干；B型架構(gòu)，發(fā)射光（熒光）相干；C型架構(gòu)，兩者同時(shí)相干。APD：雪崩光電二極管；BS：50/50分光鏡；DM：二向色鏡；L：透鏡；M：反射鏡；SM：掃描鏡。

4Pi顯微術(shù)與超分辨顯微術(shù)的結(jié)合可以進(jìn)一步提高系統(tǒng)的三維分辨率，特別是軸向分辨率。與單物鏡版本的超分辨顯微術(shù)類(lèi)似，4Pi超分辨顯微術(shù)也可以分為目標(biāo)開(kāi)關(guān)型（isoSTED、4Pi-RESOLFT）和隨機(jī)開(kāi)關(guān)型（iPALM、4Pi-SMS、4Pi-SMLM）兩類(lèi)，如圖2（a）所示。在目標(biāo)開(kāi)關(guān)型4Pi超分辨顯微術(shù)中，分別來(lái)自對(duì)置物鏡逆向傳播的兩個(gè)波前發(fā)生干涉相消，使得STED/RESOLFT聚焦光斑的中央光強(qiáng)極小值區(qū)域在軸向得到顯著壓縮［圖2（b）］。因此，熒光信號(hào)的發(fā)射被限制在焦點(diǎn)附近非常小的區(qū)域內(nèi)。而4Pi-RESOLFT和isoSTED技術(shù)的主要區(qū)別在于前者主要使用具有可逆開(kāi)關(guān)效應(yīng)的熒光蛋白（RSFP）來(lái)提供超分辨顯微術(shù)所需要的亮態(tài)和暗態(tài)。對(duì)于隨機(jī)開(kāi)關(guān)型的4Pi超分辨顯微術(shù)，軸向分辨率的提高則主要利用算法提取隱藏在干涉條紋中的軸向（z方向）位置信息［圖2（b）］。為了求解位置信息，對(duì)于不同的設(shè)計(jì)可以同時(shí)記錄三幅（iPALM）或四幅（4Pi-SMS、4Pi-SMLM）干涉相位圖。

圖2. 4Pi超分辨顯微術(shù)的簡(jiǎn)化架構(gòu)和原理示意圖。（a）isoSTED/4Pi-RESOLFT（左）與4Pi-SMLM（右）顯微鏡的簡(jiǎn)化架構(gòu)示意圖。兩種架構(gòu)在成像時(shí)都將樣品放置在物鏡共焦面上。圍繞光路的小圖標(biāo)顯示出在光路不同位置（由帶圈I?XI號(hào)標(biāo)出）光的偏振態(tài)。特別地，在位置VII、VIII和XI處，同一幅圖中的虛線(xiàn)箭頭相對(duì)于實(shí)線(xiàn)箭頭有π/2的相位延遲，該延遲是由系統(tǒng)中的石英楔造成的。左圖：在isoSTED/4Pi-RESOLFT顯微鏡中，兩束STED光，即STEDxy（橫向）和STEDz（軸向）互不相干并保持垂直的偏振態(tài)。兩束光通過(guò)一個(gè)偏振分光棱鏡（PBS）合束后，再經(jīng)過(guò)一組掃描鏡進(jìn)入4Pi干涉腔。合束后的光經(jīng)第二個(gè)PBS分束后，在物鏡的共焦點(diǎn)位置分別生成STEDxy（橫向）和STEDz（軸向）損耗光聚焦光斑［如圖（b）從左起第一和第二列所示］。兩個(gè)光斑的中央光強(qiáng)極小值（即焦點(diǎn)）位置互相重合，并通過(guò)受激發(fā)射對(duì)熒光發(fā)射現(xiàn)象產(chǎn)生各向同性的損耗作用［如圖（b）從左起第三列所示］。這種作用是通過(guò)迫使被STED光照射的熒光分子持續(xù)性地處于暗態(tài)的方式發(fā)揮效用的。同時(shí)，焦點(diǎn)附近的熒光信號(hào)被兩個(gè)物鏡反向收集。收集到的熒光光子在一片二向色鏡上發(fā)生反射，并最終進(jìn)入探測(cè)器。右圖：在4Pi-SMLM顯微鏡中，熒光光束被一組分束器反復(fù)分束和合束，以形成一系列具有不同干涉相位的光波波前。這些光波波前的相互干涉圖樣最終被位于干涉腔之后的相機(jī)同時(shí)接收。雖然在不同的設(shè)計(jì)中，具體的光路和探測(cè)器的數(shù)量不同，但所使用的單分子定位原理都是相通的，即經(jīng)過(guò)干涉條紋調(diào)制后的PSF相比原有的PSF含有更多的高頻信息，因此利用4Pi-PSF進(jìn)行定位計(jì)算，所得到的結(jié)果可以更加精確。（b）4Pi超分辨顯微鏡中的PSF軸向平面（xz平面）強(qiáng)度剖視圖。從左至右：isoSTED/4Pi-RESOLFT顯微鏡中的STEDxy、STEDz、合并后的STED（紅色），以及有效PSF（綠色）；4Pi-SMLM顯微鏡中相對(duì)相位差? = 0、90°、270°、180°時(shí)的熒光干涉PSF。為了更準(zhǔn)確地描述isoSTED/4Pi-RESOLFT顯微鏡及4Pi-SMLM顯微鏡的各種PSF，在相應(yīng)圖片的右上角給出了在探測(cè)器（APD或相機(jī)）上測(cè)得的橫向平面（焦平面，即xy平面）內(nèi)的熒光強(qiáng)度分布。GW：玻璃窗口；HWP：半波片；Q：石英楔；VP：0~2 π渦旋相位板；s/p： s偏振光/p偏振光。

下面將詳細(xì)討論4Pi超分辨顯微術(shù)的兩種架構(gòu)和它們的具體應(yīng)用。需要強(qiáng)調(diào)的是，圖像干涉非相干結(jié)構(gòu)光照明干涉顯微術(shù)（image interference and incoherent-illumination-interference structured illumination microscopy， I5S）并不在本文的討論范疇。與I5M相比，I5S顯微術(shù)在橫向上利用結(jié)構(gòu)光照明，實(shí)現(xiàn)了對(duì)有效PSF的三維壓縮。但是，從原理上講，I5S顯微術(shù)并不依賴(lài)任何熒光的開(kāi)關(guān)效應(yīng)，即該技術(shù)既不需要目標(biāo)開(kāi)關(guān)也不需要隨機(jī)開(kāi)關(guān)。這使得I5S幾乎可與任何熒光分子兼容，因此在具體應(yīng)用上會(huì)擁有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)。然而，也正因?yàn)槿绱耍诶碚撋?，I5S相對(duì)于寬視場(chǎng)顯微術(shù)也僅能將分辨率提高兩倍。為了進(jìn)一步提高分辨率，則需要在顯微鏡中引入諸如熒光飽和的各種熒光非線(xiàn)性效應(yīng)。但是遺憾的是，基于熒光飽和的I5S（或稱(chēng)為“I5SS”）至今仍未實(shí)現(xiàn)。

二、基于目標(biāo)開(kāi)關(guān)的4Pi超分辨顯微術(shù)

STED超分辨顯微術(shù)是基于1994年提出的理論模型發(fā)展起來(lái)的。該技術(shù)首先于1999年被實(shí)現(xiàn)并被用于材料學(xué)研究，并隨即在2000年實(shí)現(xiàn)了在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。自此，STED徹底改變了熒光成像的范式。STED是首個(gè)被實(shí)現(xiàn)的基于目標(biāo)開(kāi)關(guān)原理的超分辨顯微術(shù)。其基本工作原理是：在某一確定位置，通過(guò)熒光發(fā)射損耗效應(yīng)將熒光發(fā)射限制在其周?chē)粋€(gè)亞衍射極限的區(qū)域內(nèi)。當(dāng)工作時(shí)，一個(gè)光強(qiáng)最強(qiáng)點(diǎn)位于中心的激發(fā)光斑和一個(gè)環(huán)形的STED光斑相互嵌套并掃描樣品上的整個(gè)成像區(qū)域，在此期間，通過(guò)一個(gè)與焦點(diǎn)共軛的點(diǎn)探測(cè)器順次讀取信號(hào)并生成最終的圖像。為了提高STED顯微術(shù)的分辨率，STED光斑中心點(diǎn)之外的熒光發(fā)射都必須得到有效損耗。因此，一個(gè)高質(zhì)量、中央光強(qiáng)為零的環(huán)形光斑對(duì)于提升STED顯微鏡的表現(xiàn)顯得尤為重要。

過(guò)去15年的技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)使STED顯微術(shù)邁進(jìn)了三維成像的新紀(jì)元。在眾多具體的實(shí)現(xiàn)方法中，基于兩個(gè)對(duì)置物鏡的4Pi架構(gòu)，由于可以在軸向生成非常銳利的STED聚焦暗斑而尤為引人注目。雖然其分辨率優(yōu)勢(shì)沒(méi)有得到充分的發(fā)揮，但是早期的所謂STED-4Pi顯微術(shù)已經(jīng)能夠在焦平面附近提供約33 nm的軸向分辨率。而作為其改良版本的isoSTED顯微術(shù)則已能提供各向同性的三維高分辨率圖像［圖2（a）］。為了實(shí)現(xiàn)各向同性的三維熒光壓縮，isoSTED顯微術(shù)同時(shí)使用了兩個(gè)光強(qiáng)零點(diǎn)重合的STED聚焦光斑：其中一個(gè)用于橫向（STEDxy）壓縮，而另一個(gè)則用于軸向（STEDz）壓縮，如圖2（b）所示。通過(guò)對(duì)兩個(gè)聚焦光斑的光強(qiáng)分配進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以實(shí)現(xiàn)PSF大?。捶直媛剩┑木?xì)操控。其中，為了生成STEDz聚焦光斑，需要將分別來(lái)自于兩個(gè)對(duì)置物鏡、相向傳播的光波波前在焦平面上完美重合并形成干涉相消。由于單物鏡PSF中的光強(qiáng)和相位對(duì)于焦平面高度對(duì)稱(chēng)，干涉相消除了在焦面中央產(chǎn)生一個(gè)光強(qiáng)零點(diǎn)外，在焦面上下都會(huì)產(chǎn)生一系列周期性分布的光強(qiáng)零點(diǎn)。這些次級(jí)光強(qiáng)零點(diǎn)會(huì)與激發(fā)光和探測(cè)光（熒光）PSF相重合。由于在這些次級(jí)光強(qiáng)零點(diǎn)附近，STED光沒(méi)有熒光發(fā)射損耗能力，進(jìn)而造成熒光信號(hào)泄漏，最終產(chǎn)生了有效PSF中的旁瓣，并造成使圖像質(zhì)量明顯惡化的軸向“鬼影”（ghost images）現(xiàn)象。更為嚴(yán)重的是，當(dāng)使用這樣的有效PSF掃描整個(gè)樣品時(shí)，由于上下光路光程差的存在，PSF中的光強(qiáng)極大值點(diǎn)會(huì)在PSF的包絡(luò)下產(chǎn)生軸向飄移。因此，任何試圖使用一成不變的PSF進(jìn)行反卷積運(yùn)算以消除旁瓣的努力都是徒勞的。理論上，基于可變PSF的反卷積運(yùn)算可能會(huì)減輕“鬼影”現(xiàn)象，但是該方法僅適用于可以精確估計(jì)PSF并且圖像信噪比很高的場(chǎng)合（這在現(xiàn)實(shí)中都很難做到）。為了消除有效PSF中旁瓣的影響，一種有效的策略是加入離焦量，使兩個(gè)物鏡的聚焦光斑產(chǎn)生反向偏移，從而破壞STEDz聚焦光斑中的對(duì)稱(chēng)性。這個(gè)策略可以通過(guò)使用相位板添加附加相位的方法實(shí)現(xiàn)。雖然類(lèi)似的效果也可以通過(guò)直接調(diào)節(jié)兩個(gè)對(duì)置物鏡間的距離，從而破壞二者的共焦性的方式實(shí)現(xiàn)，但是使用相位板不會(huì)造成熒光信號(hào)和橫向分辨率的損失。因而相比較而言，使用相位板的策略更加有優(yōu)勢(shì)。與STEDz聚焦光斑類(lèi)似，STEDxy聚焦光斑也是通過(guò)分別來(lái)自于兩個(gè)對(duì)置物鏡、相向傳播的光波前干涉實(shí)現(xiàn)的，但需要利用干涉相加而非相消。值得注意的是，雖然與單物鏡系統(tǒng)相比，isoSTED顯微鏡中的STED聚焦光斑光強(qiáng)分布和所使用的總功率都比較接近，但是由于干涉的作用，其峰值光強(qiáng)是使用單物鏡STED顯微鏡的兩倍。基于改進(jìn)版的Abbe公式可知：在這種情況下分辨率大約可以提高倍。

與一般的共聚焦顯微鏡相比，isoSTED顯微鏡的熒光光斑大小大概只有前者的1/1500，意味著isoSTED顯微鏡的三維分辨率可以達(dá)到20~50 nm。不斷增強(qiáng)的成像能力使得isoSTED顯微鏡成為專(zhuān)門(mén)針對(duì)透明樣品進(jìn)行納米級(jí)三維成像的強(qiáng)大平臺(tái)。迄今為止，isoSTED顯微術(shù)已在多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在其發(fā)明后不久，一臺(tái)isoSTED顯微鏡就被用于材料科學(xué)領(lǐng)域?qū)ξ⒔Y(jié)構(gòu)的自組裝效應(yīng)進(jìn)行研究。這些結(jié)構(gòu)由嵌段共聚物系統(tǒng)［苯乙烯-嵌段-2-乙烯基吡啶，圖3（a）］形成，其中的乙烯基吡啶被Atto 647N特異性標(biāo)記，以提供熒光對(duì)比度。當(dāng)共聚焦顯微鏡無(wú)法完全分辨時(shí)［圖3（b）］，相關(guān)細(xì)節(jié)在isoSTED顯微鏡下得到完美呈現(xiàn)［圖3（c）］。特別是，除了表面信息外，isoSTED顯微鏡還提供了一種非侵入式的成像手段，用于展現(xiàn)樣品的內(nèi)部的三維形貌，而這種成像能力是之前電子顯微鏡所無(wú)法提供的。

圖3. isoSTED顯微鏡在材料科學(xué)中的應(yīng)用。（a）透射電鏡（TEM）下所展現(xiàn)的溶劑退火薄膜的層狀結(jié)構(gòu)。（b）相同樣品在共聚焦顯微鏡下的成像結(jié)果，未顯示任何細(xì)節(jié)。（c）在isoSTED顯微鏡下層狀結(jié)構(gòu)得到清晰展現(xiàn)。圖中標(biāo)尺：500 nm。經(jīng)American Chemical Society許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)，2009。

除了在材料科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用外，isoSTED顯微術(shù)的重要性在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域也得到體現(xiàn)。線(xiàn)粒體是一種在能量產(chǎn)生過(guò)程中起重要作用的細(xì)胞器，是isoSTED顯微鏡的第一個(gè)成像目標(biāo)。正如20世紀(jì)50年代電子顯微鏡（EM）所顯示的那樣［圖 4（a）］，在isoSTED顯微鏡下，線(xiàn)粒體也顯示由兩種不同的膜包圍，且其直徑為200~400 nm。isoSTED顯微術(shù)的發(fā)展使科學(xué)家能夠分析納米級(jí)生物結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)整個(gè)線(xiàn)粒體中直徑約35 nm的PSF掃描成像，isoSTED顯微鏡成功繪制出F1F0-三磷酸腺苷合酶（ATPase）［圖4（b）］和線(xiàn)粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（TOMM20）［圖4（c）］ 的分布。在另一個(gè)應(yīng)用中，科學(xué)家專(zhuān)注于突觸小泡，突觸小泡是神經(jīng)元細(xì)胞中一種平均直徑為39.5 nm的低電子密度泡狀結(jié)構(gòu)。這些突觸小泡位于神經(jīng)元突觸前末端，用于儲(chǔ)存神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)于在神經(jīng)元之間傳播神經(jīng)沖動(dòng)至關(guān)重要。受益于isoSTED顯微鏡的能力，科學(xué)家還成功對(duì)海馬體周?chē)顒?dòng)區(qū)表面池的空間分布進(jìn)行成像。

圖4. isoSTED顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用。（a）線(xiàn)粒體的直徑示意圖。野生型PtK2細(xì)胞中的F1F0-ATPase（b）和TOMM20（c）在isoSTED顯微鏡下的成像結(jié)果。本圖經(jīng)ACS許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)，2009。

盡管isoSTED顯微術(shù)的軸向切片成像能力遠(yuǎn)強(qiáng)于常規(guī)STED顯微術(shù)，但對(duì)于活體生物學(xué)應(yīng)用來(lái)說(shuō)，其所需要的激光衰減功率仍然過(guò)高。為了實(shí)現(xiàn)活體樣本成像，科學(xué)家進(jìn)一步發(fā)明了4Pi-RESOLFT顯微術(shù)。作為isoSTED顯微術(shù)的衍生技術(shù)，4Pi-RESOLFT顯微術(shù)與原版的最大不同在于，使用可開(kāi)關(guān)熒光蛋白（RSFP）取代STED顯微術(shù)中常用的熒光染料對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記。這種改進(jìn)使得RESOLFT顯微術(shù)尤其適用于活體細(xì)胞成像，原因是RESOLFT顯微鏡需要的激光衰減功率通常要比常規(guī)STED顯微術(shù)低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)可開(kāi)關(guān)熒光蛋白的操控。

三、基于隨機(jī)開(kāi)關(guān)的4Pi超分辨顯微術(shù)

SMLM的光學(xué)分辨率已經(jīng)達(dá)到幾個(gè)納米，因此能夠?qū){米生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行光學(xué)分析。SMLM利用寬視場(chǎng)激發(fā)和探測(cè)來(lái)隨機(jī)激發(fā)和精確定位單個(gè)分子，從而實(shí)現(xiàn)超分辨能力。由于SMLM易于在傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)顯微鏡中實(shí)現(xiàn)，因此這種方法目前被廣泛使用。通常通過(guò)評(píng)估PSF的橫向信息和形狀來(lái)實(shí)現(xiàn)3D-SMLM。或者，亦可以通過(guò)同時(shí)對(duì)多個(gè)焦平面成像來(lái)獲得單分子的軸向位置。取決于探測(cè)的不同光子，這種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)20~30 nm的橫向分辨率，而獲得的軸向分辨率相對(duì)來(lái)說(shuō)略低。

與傳統(tǒng)的單物鏡3D-SMLM系統(tǒng)相比，4Pi-SMLM通過(guò)利用由兩個(gè)對(duì)置物鏡所檢測(cè)的熒光信號(hào)的干涉來(lái)顯著提高軸向分辨率。兩個(gè)對(duì)置物鏡通過(guò)收集幾乎完整的球面波波前，使孔徑角增加并使探測(cè)到的光子數(shù)量加倍。此外，當(dāng)兩個(gè)軸向成像光路的光程長(zhǎng)度在相干長(zhǎng)度內(nèi)時(shí)，重疊兩個(gè)探測(cè)光路會(huì)導(dǎo)致單個(gè)光子的自干涉。隨后同時(shí)記錄單個(gè)分子的三個(gè)或四個(gè)不同干涉相位圖。由于干涉相位對(duì)熒光團(tuán)的軸向位置高度敏感，利用4Pi-SMLM得到的軸向分辨率比使用單物鏡系統(tǒng)獲得的軸向分辨率高6~10倍，在某些情況下甚至超過(guò)了橫向分辨率。

單物鏡納米顯微鏡的軸向分辨率可達(dá)約60 nm，但需要使用明亮的合成熒光染料。使用較暗的熒光蛋白（FP）獲得的表現(xiàn)通常較差。相比之下，理論上4Pi-SMLM通過(guò)在每個(gè)物鏡中收集單個(gè)熒光團(tuán)的250個(gè)光子便可實(shí)現(xiàn)亞10 nm的三維分辨率。因此，4Pi-SMLM適用于成像被更暗的光活化熒光蛋白（PA-FP）標(biāo)記的生物樣品。特別是在活體細(xì)胞成像中，內(nèi)源性表達(dá)的PA-FP相對(duì)于合成熒光染料有幾個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)：它們可以被更溫和地固定，并且細(xì)胞可以被重新置于生理性培養(yǎng)基中。與合成熒光染料相比，熒光蛋白不需要除氧成像緩沖液和可能引起干擾的清潔試劑或處理來(lái)控制單分子的光物理特性。

即使使用熒光信號(hào)更暗淡的PA-FP，4Pi-SMLM的三維分辨率仍可以達(dá)到小于20 nm，從而使生物學(xué)家能夠在三維空間更清晰地觀察生物樣品的細(xì)節(jié)信息。細(xì)胞外基質(zhì)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的細(xì)胞黏著斑（FA）的連接在形態(tài)建成、免疫和傷口愈合中至關(guān)重要。在細(xì)胞邊緣突出期間，F(xiàn)A形成小于250 nm的簇狀整聯(lián)蛋白、FA激酶和樁蛋白。FA的多層蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)于理解其功能至關(guān)重要。對(duì)于FA中不同蛋白質(zhì)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)成像，最理想的方法是，將4Pi-SMLM與用PA-FP標(biāo)記的FA結(jié)合。利用4Pi-SMLM的三維各向同性的納米級(jí)分辨率能力，Kanchanawong等發(fā)現(xiàn)在不同大小和形狀的FA中，每個(gè)FA成分的軸向分布高度一致，表明蛋白質(zhì)在FA中的位置可調(diào)節(jié)其活性和功能。Case等則使用類(lèi)似的策略調(diào)節(jié)黏著斑蛋白的激活和功能。

此外，對(duì)于許多不同生物系統(tǒng)，特別是那些需要超高分辨率的生物系統(tǒng)，4Pi-SMLM還提供了深刻的定量生物學(xué)闡釋。轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)體分選復(fù)合物（ESCRT）的納米級(jí)結(jié)構(gòu)［被人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）劫持］已經(jīng)在病毒出芽點(diǎn)被4Pi-SMLM解析。ESCRT亞單位的空間結(jié)構(gòu)表明，HIV釋放的驅(qū)動(dòng)力可能來(lái)源于病毒芽?jī)?nèi)部ESCRT亞單位的初始支架。兩個(gè)離散的桶狀結(jié)構(gòu)（每個(gè)桶狀結(jié)構(gòu)由幾十個(gè)單獨(dú)的Nup188簇組成）也被4Pi-SMLM在細(xì)胞纖毛基底位置成功解析。這種結(jié)構(gòu)特征證明了Nup199將中心粒包裹在桶狀結(jié)構(gòu)中的假說(shuō)。此外，三維的4Pi-SMLM圖像被用于量化分泌機(jī)制中蛋白質(zhì)的數(shù)量。Zhang等展示了分泌系統(tǒng)中PrgH蛋白在細(xì)菌細(xì)胞膜附近形成的各種大小的三維分子簇（圖5）。最近，4Pi-SMLM也已被成功用于解析異質(zhì)納米級(jí)交聯(lián)的三維組織，為微凝膠形成動(dòng)力學(xué)提供了深刻的見(jiàn)解。

圖5. 使用4Pi-SMLM對(duì)不同生物樣品進(jìn)行超高分辨率三維成像。（a）由細(xì)菌細(xì)胞膜附近的分泌系統(tǒng)蛋白PrgH形成的分子簇的三維成像。（b）來(lái)自58個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的PrgH簇的累積4Pi-SMLM圖像。本圖經(jīng)National Academy of Science許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)，2017。

除了在生物學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，4Pi-SMLM在其他領(lǐng)域也得到不斷發(fā)展，目前也具備越來(lái)越高的成像能力。當(dāng)4Pi-SMLM概念被首次實(shí)現(xiàn)時(shí)，成像深度被限制在一個(gè)干涉周期內(nèi)（發(fā)射波長(zhǎng)的一半，約250 nm）。這是因?yàn)楦缮婀鈴?qiáng)是周期性的，屬于相鄰干涉條紋的光強(qiáng)峰值無(wú)法被區(qū)分。兩種方法可以解決上述問(wèn)題：第一種方法是在4Pi-PSF中引入像散。因此，PSF的整體形狀可以用于展開(kāi)不同周期中的干涉相位，從而將成像深度擴(kuò)展到與基于散光的3D-SMLM方法所能提供的同樣深度（約1 μm）。第二種方法基于發(fā)射的波前是球形的而非平面的概念，利用第零中心矩和第三中心矩的光強(qiáng)振蕩不同的特點(diǎn)，精確地定位不同周期中的z位置。最近，自適應(yīng)光學(xué)已經(jīng)被引入4Pi-SMLM，從而實(shí)現(xiàn)了全細(xì)胞成像（圖6）。此外，多色成像也被引入4Pi-SMLM。第一次雙色4Pi-SMLM成像的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)發(fā)射光中的s偏振光與p偏振光的比率來(lái)判定熒光團(tuán)顏色。最近，利用由激發(fā)二向色鏡反射的回收熒光實(shí)現(xiàn)了三色4Pi-SMLM成像。另一個(gè)令人興奮的進(jìn)展是4Pi-SMLM和電子顯微鏡的關(guān)聯(lián)成像。4Pi-SMLM的高分辨率和高分子特異性與電子顯微鏡結(jié)合大大縮小了熒光顯微鏡和電子顯微鏡之間的分辨率差距，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)與電子顯微鏡圖像更好的重疊。

圖6. 小鼠精母細(xì)胞聯(lián)會(huì)復(fù)合體的4Pi-SMLM成像。（a）利用21個(gè)光學(xué)切片重建的全細(xì)胞的整體圖像。精母細(xì)胞內(nèi)部頂部（b）和底部（c）位置的4Pi-SMLM圖像。（d）（a）圖中的x—z視圖。本圖經(jīng)Elsevier許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)，2016。

用于單物鏡3D-SMLM的理論極限精度已經(jīng)可以通過(guò)基于熒光球的實(shí)驗(yàn)PSF模型和極大似然估計(jì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，然而傳統(tǒng)的基于相對(duì)光強(qiáng)的4Pi-SMLM的數(shù)據(jù)分析方法并不能達(dá)到理論分辨率極限。這是因?yàn)榛谙鄬?duì)光強(qiáng)的方法并沒(méi)有利用條紋狀干涉4Pi-PSF中的高頻信息來(lái)提升分辨率。三次樣條插值的相位恢復(fù)的4Pi-PSF模型的開(kāi)發(fā)，使得4Pi-SMLM可以達(dá)到理論分辨率極限。然而，由于4Pi-PSF本質(zhì)上是四維的（x、y、z和相位），簡(jiǎn)單的多通道三維PSF模型不適合用于描述4Pi-PSF。Li等最近提出的4Pi-PSF模型將4Pi-PSF的三維位置和相位項(xiàng)進(jìn)行解耦。他們不直接使用四維4Pi-PSF模型，而是通過(guò)三個(gè)三維矩陣和一個(gè)簡(jiǎn)單的相位項(xiàng)的結(jié)合來(lái)完整描述四維4Pi-PSF，使得四維4Pi-PSF的實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)在實(shí)踐中易于實(shí)現(xiàn)，從而發(fā)揮4Pi-SMLM的全部潛力。

四、討論與展望

利用熒光的特異性標(biāo)記能力，光學(xué)超分辨顯微術(shù)已被證明是一種用于在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中探尋分子細(xì)節(jié)的有效方法。相關(guān)技術(shù)仍然在不斷發(fā)展，以期提供多色、三維、活體細(xì)胞成像的納米級(jí)顯微成像能力。針對(duì)本文之前的討論，圖7給出了4Pi顯微術(shù)的技術(shù)演進(jìn)路線(xiàn)?，F(xiàn)階段，大多數(shù)超分辨顯微術(shù)已有能力提供50~100 nm的空間分辨率。然而，如果空間分辨率能夠在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升一個(gè)數(shù)量級(jí)，那么生物學(xué)家就有望能直接觀察大型分子復(fù)合體內(nèi)的單個(gè)分子基團(tuán)的三維圖像。如果這一夢(mèng)想得以實(shí)現(xiàn)，生物學(xué)家就可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的分子機(jī)制進(jìn)行原位成像，觀察其結(jié)構(gòu)和分子組成。這種能力對(duì)于許多的生物學(xué)研究至關(guān)重要，例如，在這樣的分辨率下可以對(duì)DNA構(gòu)象進(jìn)行三維觀察，以理解染色體DNA的包裝和基因調(diào)控。在現(xiàn)階段，為了具備這種能力，理論上可以通過(guò)在隨機(jī)開(kāi)關(guān)納米顯微鏡中，將單個(gè)熒光發(fā)射器的光子數(shù)量增加兩階，或在靶向開(kāi)關(guān)超分辨顯微鏡中將STED激光衰減功率提升兩個(gè)數(shù)量級(jí)。然而，如此高劑量地增加光子數(shù)或激光強(qiáng)度，通常不利于實(shí)際的生物實(shí)驗(yàn)。相比之下，如果基于雙物鏡4Pi而非單物鏡架構(gòu)，相同超分辨顯微術(shù)在軸向的分辨率幾乎可以提高3~10倍。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將分辨率提高一個(gè)數(shù)量級(jí)，而且不需要滿(mǎn)足熒光標(biāo)記的嚴(yán)格特性或苛刻的成像條件。

圖7. 4Pi顯微術(shù)技術(shù)發(fā)展路線(xiàn)圖。

除了4Pi超分辨顯微術(shù)外，其他技術(shù)也可能將軸向分辨率提高到亞50 nm的水平。例如，用于納米形貌的點(diǎn)累積成像（PAINT）技術(shù)及進(jìn)一步發(fā)展的DNA-PAINT技術(shù)便是其中之一。該技術(shù)在樣品制備過(guò)程中用熒光配體的隨機(jī)結(jié)合代替了永久結(jié)合的熒光團(tuán)的隨機(jī)光活化。另一種通過(guò)樣品制備提升分辨率的方法是樣品膨脹顯微術(shù)（ExM）。通過(guò)使用可鼓脹的聚合物網(wǎng)絡(luò)放大樣品，ExM允許研究人員識(shí)別其中的微小結(jié)構(gòu)。除此之外，在儀器學(xué)發(fā)展方面，最小化熒光光子通量顯微術(shù)（MINFLUX）是迄今最先進(jìn)的用于精確定位熒光分子的方法。一般SMLM通過(guò)算法定位一幅圖像中稀疏分布的熒光光斑的質(zhì)心或最強(qiáng)點(diǎn)位置來(lái)實(shí)現(xiàn)單分子功能，而MINFLUX則通過(guò)激發(fā)光斑中央的暗斑來(lái)進(jìn)行定位的。除此之外，人工智能技術(shù)的發(fā)展也為將衍射受限的輸入圖像轉(zhuǎn)變?yōu)槌直鎴D像提供了另一種途徑，或者顯著降低了利用超分辨顯微術(shù)進(jìn)行活體細(xì)胞成像時(shí)的照明光劑量。

到目前為止，這些新興技術(shù)的使用效果僅在單物鏡架構(gòu)的顯微鏡中得到了驗(yàn)證。值得注意的是，并不存在上述技術(shù)無(wú)法與4Pi架構(gòu)兼容的障礙。如果類(lèi)似的結(jié)合一旦成功，人們一樣可以期待它們能夠提供更高的三維分辨率或更好的信噪比之類(lèi)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，就跟目前在isoSTED和4Pi-SMLM顯微術(shù)中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的一樣。然而，主要挑戰(zhàn)來(lái)自于系統(tǒng)復(fù)雜性的增加：4Pi架構(gòu)除了需要針對(duì)這些新興概念進(jìn)行專(zhuān)門(mén)的額外系統(tǒng)優(yōu)化外，還需要對(duì)大量并行參數(shù)進(jìn)行細(xì)致的調(diào)整。如果處理不當(dāng)，此類(lèi)問(wèn)題會(huì)嚴(yán)重影響系統(tǒng)性能。事實(shí)上，大多數(shù)4Pi顯微鏡或超分辨顯微鏡都只能在全球少數(shù)實(shí)驗(yàn)室中得到有效維護(hù)和使用。為了使更多的非光學(xué)專(zhuān)業(yè)人士能夠使用4Pi顯微鏡，有必要進(jìn)一步公開(kāi)4Pi顯微鏡的設(shè)計(jì)圖紙、軟件、操作和樣品制備方法，同時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步簡(jiǎn)化現(xiàn)有4Pi顯微鏡的設(shè)計(jì)。令人欣喜的是，科學(xué)家已經(jīng)在這方面取得了顯著進(jìn)展。例如，在isoSTED顯微鏡的初始設(shè)計(jì)中，需要兩個(gè)獨(dú)立的STED激光光束來(lái)分別生成STEDxy和STEDz聚焦光斑。顯而易見(jiàn)，如果能夠使用單一激光器作為STED光源，可以有效降低系統(tǒng)復(fù)雜度，提高成像過(guò)程中的穩(wěn)定性?；诖?，科學(xué)家提出了兩種方案：一種是引入基于空間光調(diào)制器的雙反射架構(gòu)來(lái)分別編碼激光光束中兩個(gè)正交的偏振分量，從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)STEDxy和STEDz聚焦光斑；另一種則是在光路中插入一個(gè)分段的、具有高度波長(zhǎng)選擇性的波片元件。兩種設(shè)計(jì)都已實(shí)現(xiàn)并證明其可以有效地實(shí)現(xiàn)isoSTED成像。

考慮到4Pi顯微鏡中干涉腔的高度對(duì)稱(chēng)性，一種更為“激進(jìn)”的策略是完全去除其中一個(gè)物鏡，并使用一個(gè)反射鏡取代通常用來(lái)托住樣品的載玻片。這樣的設(shè)計(jì)被稱(chēng)為鏡面輔助分辨率提升技術(shù)（MEANS）。在MEANS顯微鏡中，入射光和反射光可以模擬常規(guī)4Pi顯微鏡中兩束反向傳播的光束，進(jìn)而在鏡面上產(chǎn)生局部干涉以限制PSF的軸向尺寸。雖然MEANS的初始設(shè)計(jì)僅能夠在緊貼鏡面的二維平面內(nèi)提高軸向分辨率，但是其優(yōu)越性在于，這種架構(gòu)可能既可以用于目標(biāo)開(kāi)關(guān)超分辨顯微術(shù)也可以用于隨機(jī)開(kāi)關(guān)超分辨顯微術(shù)?？傊琈EANS顯微鏡提供了一種用于提高單物鏡系統(tǒng)軸向分辨率的一般性策略，因此，有望改造許多現(xiàn)有的單物鏡系統(tǒng)，從而以一種虛擬的方式為更多實(shí)驗(yàn)室提供使用4Pi顯微鏡的可能。

由于各類(lèi)不同的4Pi超分辨顯微術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，相關(guān)的理論體系亦已建立完備，下一階段的研究重點(diǎn)將是如何使得相關(guān)技術(shù)以更好地解決實(shí)際的科學(xué)問(wèn)題。不難理解，如果要發(fā)揮4Pi雙對(duì)置物鏡架構(gòu)的最大效能，觀察樣品必須是完全透明的。為了在整個(gè)成像過(guò)程中保持穩(wěn)定的干涉模式，4Pi顯微鏡對(duì)由樣品折射率不均勻引起的像差很敏感。盡管已有少量關(guān)于4Pi顯微鏡被用于細(xì)胞學(xué)研究的報(bào)道，但是相關(guān)技術(shù)在厚樣品的應(yīng)用還幾乎完全沒(méi)有被研究，如生物組織方面。為了實(shí)現(xiàn)4Pi顯微術(shù)在生物組織中的應(yīng)用，需要解決樣品像差問(wèn)題。因此，必須首先建立一個(gè)用于描述像4Pi這類(lèi)具有多個(gè)非連續(xù)圓形入瞳的顯微鏡像差的數(shù)學(xué)模型。同時(shí)，還需要在系統(tǒng)中引入自適應(yīng)光學(xué)用于對(duì)樣品像差的補(bǔ)償。相關(guān)的理論已經(jīng)啟發(fā)了一些將4Pi顯微術(shù)用于全細(xì)胞和組織切片樣品成像的前瞻性工作。雖然致力于將4Pi顯微術(shù)用于厚樣品成像的研究工作已經(jīng)開(kāi)始，但其全部潛力還遠(yuǎn)未被發(fā)掘。在這個(gè)進(jìn)程當(dāng)中尤為關(guān)鍵的一步則是如何將4Pi顯微術(shù)運(yùn)用到活體樣品成像中。

審核編輯：郭婷