熒光檢測是當下最靈敏的光譜檢測技術之一，通過對光源調頻可以選擇激發(fā)躍遷的初始狀態(tài)和終了狀態(tài)，因此可以解析分子的十分復雜的譜帶，與其他光譜法相比，其具有靈敏度高、適用性好等優(yōu)點。然而，光學元件的小型化和光學配置是小型化熒光檢測器發(fā)展的兩大挑戰(zhàn)。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近期，來自上海應用技術大學的研究人員于《微納電子技術》期刊發(fā)表論文，設計并制備了搭載熒光修飾核酸探OMUpy2-probe的微芯片的兩種優(yōu)化結構。第一種結構應用薄膜的光干涉效應，通過濕法腐蝕法制備石英薄膜，腐蝕過程中采用Cr作為保護膜形成石英玻璃、石英薄膜和石英玻璃的三層結構，減少了原聚二甲基硅氧烷（PDMS）層在波長400-500nm的背景熒光；第二種結構利用核酸的內容位點帶負電，通過電泳的方式對核酸進行濃縮，并將Au電極連接到200μm寬的流路的兩側，設置電極電壓為0.1V，進行電泳濃縮實驗?？傊?，該研究提出的兩種優(yōu)化結構彌補了原芯片在光學實驗中和低濃度實驗條件下的缺陷。

PDMS層的改進

原芯片分為兩部分，分別為具有高透光率和易于加工的PDMS層組成的上部和具有優(yōu)異紫外光透射率的石英玻璃層組成的下部。PDMS材料可通過簡單的方法用于構建各種模式的通道。然而，從迄今為止報道的實驗中發(fā)現(xiàn)，在絕大多數(shù)PDMS芯片中，PDMS層會顯示自發(fā)的高熒光，由于激發(fā)光的反射，熒光光譜的背景干擾會增強。

而石英具有獨特的光學特性，且石英玻璃耐高溫、熱膨脹系數(shù)極小、化學熱穩(wěn)定性好，因此，在該研究中，研究人員采用石英替代了原芯片使用的PDMS。但更替為石英無法完全抑制散射光反射，相反，石英玻璃可能因材質會使光學均勻性不穩(wěn)定，并導致其熒光更加分散，從而使散射光再次激發(fā)，所以研究人員在制備過程中應用了薄膜的光干涉效應。具體來看，研究人員在由石英玻璃構成的流路層上添加一層由石英玻璃構成的薄膜，然后和下部的石英玻璃鍵合，構成石英玻璃、石英薄膜與石英玻璃的三層結構，如圖1所示。薄膜制備和芯片制備流程圖如圖2所示。

圖2 薄膜制備和石英芯片制備流程圖

在考慮了熒光檢測芯片原材料的優(yōu)化后，研究人員設計了一種電化學濃縮核酸的方法，以便在低濃度區(qū)域進行檢測。此外，研究人員采用了兩種電極使用方法：一種是電極從流路兩端接入；另一種是電極從流路側方接入。為了確認芯片能否進行核酸濃縮，使用制備的石英芯片，采用第一種電極接入方法，在微溝道中插入鉑絲（Pt）作為體電極來確認熒光標記的RNA（濃度為1μmol/L）的電泳。體電極核酸濃縮示意圖如圖3所示。

圖3 體電極核酸濃縮示意圖

而第二種方法采用剝離工藝，以Cr/Al作為電極材料，制作了Cr/Al薄膜電極。電極從流路側方接入，Cr/Al薄膜電極的制備流程圖如圖4所示。因在后續(xù)實驗過程中出現(xiàn)了電極脫落的現(xiàn)象，研究人員將電極材料由Cr/Al改為Au，制備流程與圖4流程基本一致，實驗示意圖如圖5所示，將Au電極與微溝道相連接（圖5（a）），然后用Cu作為導電材料連接Au電極，使用折射率為1.516的顯微鏡浸油和倍數(shù)100的物鏡進行觀察（圖5（b））。

進一步實驗結果發(fā)現(xiàn)，當電極材質為Au、電極電壓在0.82V以下時，才能使電極不發(fā)生脫落，樣品溶液不發(fā)生電解。當電極電壓為0.1V、電泳時間達到80s時，核酸濃度比和熒光強度為最大值，核酸濃度比提高了約6.07倍，熒光強度提高了約2.28倍。綜上所述，所制備的微芯片既能改善熒光背景誤差，又能在低濃度樣品下濃縮核酸，提高熒光強度。

圖6 樣品濃度為1μmol/L、電極電壓為0.1V時不同電泳時間的熒光效果圖