本文提出一種離心微流控芯片通過 LAMP 和比色檢測實現(xiàn)多種食物傳染性病原體鑒定。該芯片具有五種相同的結(jié)構(gòu)，可一次性實現(xiàn) 25 個病原體分析。

如圖 1 所示芯片直徑為 120 mm，一次性可同時執(zhí)行 5 種樣本。其中，兩種曲折形的微通道分別用于裝載 LAMP 混合物 (橙色) 和 LAMP 引物混合物 (藍色)。

圖 1

其中，橙色微通道的尺寸為 1000 x 800 μm ( width x depth ), 含有 LAMP 引物混合物的藍色微通道尺寸為 750 x 600 μm ( width x depth )。一個反應(yīng)單元中 LAMP 混合物和 LAMP 引物混合物相應(yīng)的注入體積為 72.5 μl 和 22.5 μl。將 6 μl DNA 樣品溶液單獨裝入樣品腔。 如圖 2 所示，連接微通道的尺寸: #1 : 500 x 250 μm (width x depth), #2: 250 x 125 μm (width x depth), #3: 100x125 μm (width x depth)。



圖 2 反應(yīng)腔中設(shè)計了空氣流通結(jié)構(gòu)，以便溶液易于轉(zhuǎn)移并防止加載的溶液產(chǎn)生倒流現(xiàn)象。

圖 3 為芯片實物圖。由于芯片上具有五個相同的單元，所以總共可以實時進行 25 組 LAMP 反應(yīng)。

圖 3

圖 4 描述了芯片的組成過程:從上到下依次為，一個 1mm 厚的 PC 層 , 一個 30 um 厚的雙面膠 , 一個 1 mm 厚的 PC 層，一個壓敏粘合箔。在室溫下采用 100 MPa 的熱壓機將組裝后的四層緊密粘合。

圖 4

芯片流程操作如圖 5 所示。 首先將 2xLAMP 緩沖液 (312.5μL 可進行 25次反應(yīng)) 與 EBT (25μL, 3 mM) 和 Bst 2.0 DNA 聚合酶 (25μL, 16 Unit/μL) 混合來制備 LAMP 混合物 (362.5μL / 5 = 72.5μL)。隨后，將包含 EBT 和聚合酶的 LAMP 混合物注入橙色的曲折微通道中。含有LAMP 引物的混合液總體積為 112.5μL (112.5μL / 5 = 22.5μL)。在黃色樣本腔中注入含有細菌基因組 DNA 樣本的溶液 (150μL / 25 = 6μL)(圖 5b)。

圖5

然后將芯片放置到離心系統(tǒng)上，控制轉(zhuǎn)速將腔室內(nèi)部的溶液按序注入 25 個反應(yīng)腔。連接通道#1, #2, #3 處的爆破轉(zhuǎn)速分別為 522rpm, 808rpm, 1739rpm。 圖 5c 設(shè)置 500rpm 將 LAMP 混合物注入到反應(yīng)腔。在 1000rpm 時，LAMP 引物混合物開始流動，并被轉(zhuǎn)移到反應(yīng)腔（圖 5d）。最后，將含有細菌基因組 DNA 的樣品溶液在 2000rpm 時裝入反應(yīng)腔。在收集了三種溶液后，通過在 0rpm 和 2000rpm 之間交替 30s 來完成三種溶液的混合。 最后將芯片放置在實驗室烘箱中，在 65 度下進行 LAMP 反應(yīng) 1h。之后，用肉眼監(jiān)測反應(yīng)腔的顏色 (圖 5f)。




審核編輯：劉清