微流控系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種體外組織工程模型中。近期，來自韓國成均館大學(xué)的GeunHyung Kim提出了一種新的微流控系統(tǒng)，用于制造在核心區(qū)域充滿各種形狀（珠子、念珠和細(xì)絲）的細(xì)胞細(xì)絲。相關(guān)研究內(nèi)容以“Formation of various cell-aggregated structures in the core of hydrogel filament using a microfluidic device and its application as an in vitro neuromuscular junction model”為題發(fā)表在Chemical Engineering Journal期刊上。

這些結(jié)構(gòu)是利用注射生物墨水的兩相流的瑞利-高原不穩(wěn)定性（膠原蛋白/聚[乙二醇]二丙烯酸酯[PEGDA]的連續(xù)相和甲基丙烯酸化明膠（GelMA）的分散相）獲得的。為了證明該系統(tǒng)在體外神經(jīng)肌肉連接模型上的潛力，將含有C2C12的膠原/PEGDA生物墨水注入鞘區(qū)域，并將與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞（NSC-34）混合的GelMA混合到制備的細(xì)胞聚集物的核心區(qū)域。由于更大的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)，核心的念珠狀NSC-34聚集物比核心區(qū)域的珠子和細(xì)絲聚集物表現(xiàn)出更高的細(xì)胞活力和更發(fā)達(dá)的神經(jīng)源性基因表達(dá)。此外，當(dāng)比較充滿細(xì)胞的支柱（鞘區(qū)C2C12和念珠核心區(qū)NSC34）與具有相同細(xì)胞密度的正常生物打印支柱時(shí)，在充滿念珠狀細(xì)胞聚集物的支柱中，肌發(fā)生、神經(jīng)肌肉連接（NMJ）和神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了制造新的細(xì)胞負(fù)載核心鞘結(jié)構(gòu)的潛力，可用于設(shè)計(jì)各種體外模型。

圖1A顯示了用于產(chǎn)生充滿纖維支柱的3D細(xì)胞聚集形狀的微流控裝置的示意圖。在該研究中使用了一個(gè)T型結(jié)微流控裝置，其中分散相被注入垂直于連續(xù)相。在T連接系統(tǒng)中將膠原蛋白/PEGDA連續(xù)流動(dòng)，而沒有在分散流動(dòng)中使用油和細(xì)胞裝載GelMA（圖1A、1B）。通過控制每個(gè)生物墨水的流變特性和流速以及原位光交聯(lián)，在核心區(qū)域獲得了三種不同的細(xì)胞聚集形狀（球體、念珠和纖維）（圖1C）。不同形狀的制造可以歸因于瑞利不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性會(huì)分散生物墨水的幾種不穩(wěn)定流（噴射流、念珠流和滴流）的穩(wěn)定共流（圖1D）。

圖1 設(shè)計(jì)一種制造細(xì)胞聚合形狀的微流控系統(tǒng)

圖2A顯示了在蛋白質(zhì)-PEGDA-水三元體系中，增加PEGDA作為結(jié)晶劑的濃度對蛋白質(zhì)的影響的示意圖。圖2B顯示了不同PEGDA濃度下膠原蛋白/PEGDA生物墨水的儲(chǔ)存模量（G’)。增加生物墨水混合物中PEGDA的濃度可以提高G''的流變性能和屈服應(yīng)力（σ），從而增強(qiáng)相鄰膠原之間的相互作用。根據(jù)混合生物油墨的透光率和印刷能力來評(píng)價(jià)這一現(xiàn)象（圖2C）。由于相分離，隨著PEGDA的加入，打印能力顯著降低。根據(jù)生物墨水的透光率和吸光度（圖2D、2E）以及打印支柱的直徑穩(wěn)定性（圖2F）對結(jié)果進(jìn)行了定量評(píng)價(jià)?；旌衔锷锬憩F(xiàn)出與原始膠原蛋白完全相似的纖維性顫動(dòng)溫度，并且在10℃下進(jìn)行光交聯(lián)過程后，膠原蛋白/PEGDA生物墨水的G'顯著增加（圖2G、2H）。

圖2 優(yōu)化膠原蛋白/PEGDA生物墨水的配方

在該研究中，研究人員固定了連續(xù)相（膠原蛋白/PEGDA生物墨水）的粘度（13.8 Pa）和流速（20 mm/s），并改變了分散相（充滿細(xì)胞的GelMA生物墨水）的粘度和流速（圖3A）。GelMA隨著溫度的升高進(jìn)行了凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變（圖3B）。通過控制細(xì)胞裝載的GelMA加工溫度，在核心區(qū)域獲得了三種細(xì)胞聚集形狀（珠子、念珠和細(xì)線，圖3C）。通過改變GelMA在核心區(qū)域的流速，改變了GelMA區(qū)域制備結(jié)構(gòu)（珠、念珠和纖維）的幾何形狀（圖3D ~ 3F）。圖3G顯示了在GelMA（15℃）溫度下的GelMA和Col/PEGDA輸入速度的過程圖，顯示了分散相的各種結(jié)構(gòu)形成。

圖3 在核心區(qū)域制造多種細(xì)胞聚集形狀

為了觀察分散流體在T型結(jié)微通道中的行為，采用流體體積（VOF）法模擬了該過程，微通道詳細(xì)幾何形狀如圖4A所示。采用液滴懸浮法測量了表面張力，這是該工藝的重要材料參數(shù)之一，其值如圖4B所示。膠原蛋白在10℃時(shí)/PEGDA的粘度和GelMA在15℃和30℃時(shí)的粘度如圖4C所示。GelMA的粘度是制備分散相念珠形的關(guān)鍵因素，GelMA生物墨的輸入速度也是影響念珠結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)（圖4D）。圖4E顯示了GelMA分散相的輸入速度對念珠形狀的結(jié)構(gòu)幾何形狀的影響（念珠之間的細(xì)線直徑r，波長λ，念珠直徑R）。圖4F顯示了通道內(nèi)念珠和珠狀結(jié)構(gòu)周圍的速度和壓力分布。結(jié)果表明，連續(xù)相對分散相施加的速度分布要快得多。圖4G為GelMA生物墨水在固定粘度（15 Pa）下的GelMA生物墨水的計(jì)算工藝圖和膠原/PEGDA生物墨水的固定材料參數(shù)，顯示了分散的相的各種結(jié)構(gòu)形狀。實(shí)驗(yàn)和模擬處理圖之間存在偏差，但GelMA處理溫度和連續(xù)分散流體速度對核心區(qū)域的制造形狀的影響也有類似的趨勢（圖4H)。



圖4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和CFD模擬之間的比較分析，以評(píng)估核心區(qū)不同GelMA聚集形狀的形成

使用了由分散相和膠原/PEGDA水凝膠連續(xù)相組成的支柱評(píng)估細(xì)胞聚集形狀對生物活性的影響（圖5A）。分散相為三個(gè)不同的細(xì)胞聚集形狀，即珠子狀，念珠形狀[RS]和纖維形狀[FS]，其中GelMA以細(xì)胞密度為2×10? cells/mL混合。圖5B、5C顯示了第3天和第7天的活（綠色）/死（紅色）細(xì)胞圖像和細(xì)胞活力，所有的支柱都顯示出足夠高的細(xì)胞活力，這表明微流控過程和原位交聯(lián)條件對負(fù)載的細(xì)胞是安全的。RS支柱中發(fā)生了細(xì)胞間和ECM之間的強(qiáng)大相互作用（圖5B、5D）。為了量化結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)源性基因的表達(dá)，在第21天測量了第1天NEFH、NeuroG1、NeuroD1和突觸蛋白1的mRNA表達(dá)（圖5F）。

圖5 各種NSC-34在核心聚集形狀的體外細(xì)胞活性

如光學(xué)和免疫熒光圖像（DAPI/MHC/NEFM）和RT-PCR結(jié)果所示，共培養(yǎng)的NSC-34和C2C12細(xì)胞的比例為1：100，顯示肌原性、NMJ-和神經(jīng)源性相關(guān)基因表達(dá)高度上調(diào)（圖6A、6B）。

圖6 不同NSC-34和C2C12混合物比值的體外細(xì)胞活性

作為對照，使用用膠原蛋白/PEGDA/GelMA生物墨水包裹的NSC-34和C2C12細(xì)胞的混合物來制造細(xì)胞負(fù)載結(jié)構(gòu)（圖7A）。圖7B顯示了通過MTT檢測的HRS結(jié)構(gòu)和對照的細(xì)胞增殖，混合念珠結(jié)構(gòu)（HRS）中細(xì)胞的增殖明顯高于對照組。圖7C顯示了用細(xì)胞追蹤器染色的每種細(xì)胞類型（綠色：C2C12；紅色：NSC-34）的熒光圖像，在圖像中對照組的細(xì)胞分布均勻，而在HRS結(jié)構(gòu)中，含NSC的GelMA在C2C12細(xì)胞裝載的膠原/PEGDA水凝膠中呈念珠狀聚集。對照和HRS結(jié)構(gòu)培養(yǎng)14和21天，觀察了神經(jīng)絲的核心亞基之一dapi/MHC/NEFM（圖7D）。

在培養(yǎng)了這些結(jié)構(gòu)之后，發(fā)現(xiàn)HRS結(jié)構(gòu)比對照更能再生肌肉組織，由幾個(gè)肌肉特異性基因（MyoG、MyoD1、MHC）（圖7E）、NMJ特異性基因（AchE、Agrin、Musk和Lrp4）（圖7F）和神經(jīng)發(fā)生基因（NeuroG1、NeuroD1、NEFH和突觸蛋白1）（圖7G）決定。一般來說，肌肉特異性基因如MHC、MyoG和MyoD1的表達(dá)表明再生組織成熟為功能性肌纖維。NMJ特異性基因的表達(dá)為再生組織的功能成熟提供了進(jìn)一步的證據(jù)，因?yàn)檫@些基因參與了NMJ的形成和維持。



圖7 比較正常細(xì)胞負(fù)荷結(jié)構(gòu)和雜交念珠結(jié)構(gòu)之間的體外NMJ形成

該研究使用T型微流控裝置創(chuàng)建了一種填充不同形狀的微尺度細(xì)胞聚集物的新型混合支柱，以研究細(xì)胞聚集物形狀對細(xì)胞活動(dòng)的影響。通過控制分散的相粘度和連續(xù)相速度，產(chǎn)生了球形、念珠狀和線狀的細(xì)胞聚集物。本研究結(jié)果顯示，膠原/PEGDA支柱中的念珠狀細(xì)胞聚集物在促進(jìn)細(xì)胞活性方面最有效，包括增強(qiáng)神經(jīng)源性活性，這是由于制造過程中細(xì)胞間的相互作用和制造過程中瑞利不穩(wěn)定性產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力。為了證明該微流控裝置的可行性，在核心中創(chuàng)建了基于GelMA的NSC-34細(xì)胞聚集物和連續(xù)階段的C2C12細(xì)胞聚集物。

與傳統(tǒng)的生物打印支柱結(jié)構(gòu)相比，裝載NSC-34的念珠結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯更高的肌源性和神經(jīng)源性分化以及NMJ的形成。本研究結(jié)果表明，這種利用混合細(xì)胞裝載結(jié)構(gòu)的新的生物制造技術(shù)具有多種組織工程應(yīng)用的潛力，包括生物芯片模型，并可能有助于增強(qiáng)組織再生。

審核編輯：劉清