天門冬氨酸胰島素（IAsp）和德谷胰島素（IDeg）作為第三代胰島素，起效時間更快或作用期更持久，可以用于模擬生理條件下胰島素的分泌。微針（MNs）是一種可以用于透皮給藥的器件，可以讓糖尿病患者輕松地進行透皮胰島素治療，同時顯著減輕注射疼痛。

近期，北京化工大學(xué)郭新東教授和荷蘭格羅寧根大學(xué)Mohammad-Ali Shahbazi共同研究了溶解性微針聯(lián)合IAsp或IDeg治療作為每日多次胰島素注射的替代方案，旨在改善血糖控制和患者依從性。此外，通過研究微針的力學(xué)性能、微針中封裝的胰島素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和透皮應(yīng)用特性，該研究評估了負載胰島素的微針在糖尿病治療中的實用性。在糖尿病大鼠體內(nèi)進行的實驗表明，負載IAsp和IDeg的微針具有與皮下注射相當(dāng)?shù)难强刂颇芰?。此外，該研究還進一步研究了負載胰島素微針在不同飲食條件下的治療特性和應(yīng)用策略，為未來的臨床試驗提供新信息。綜上所述，微針有可能改善血糖控制、低血糖風(fēng)險和方便性之間的平衡，為患者提供更簡單的治療方案。相關(guān)研究以“Functional insulin aspart/insulin degludec-based microneedles for promoting postprandial glycemic control”為題發(fā)表在Acta Biomaterialia期刊上。

如圖1所示，載藥微針整齊地排列在貼片上，大小一致，前端尖銳。藥物在微針上的分布主要集中在微針尖端（圖1A），表明采用相同的制造工藝，胰島素溶液可以選擇性地封裝在微針的尖端，以提高透皮給藥效率和供應(yīng)到體內(nèi)的劑量精度。掃描電鏡照片顯示該研究制備的微針表面光滑，沒有裂縫（圖1B3、1C3）。

圖1 制備的載藥微針形態(tài)

從微針中溶解的胰島素CD譜與原溶液CD譜高度一致，在208nm~ 209nm和220nm~ 225 nm附近有兩個小峰（圖2），表明胰島素在二級結(jié)構(gòu)中基本保持穩(wěn)定。

圖2 Asp和IDeg經(jīng)過不同處理后的圓二色光譜（CD）

與谷氨酰胺（GLN）的氮原子相連的氫原子作為氫鍵受體，接受聚乙烯醇（PVA）的氧原子形成氫鍵，而絲氨酸（SER）側(cè)基團中的氧原子可以作為氫鍵供體，與PVA的氫原子相互作用（圖3A、3B）。雖然A鏈中半胱氨酸（CYS）殘基的側(cè)基沒有相互作用位點，但其碳基結(jié)構(gòu)也使其成為氫鍵供體，吸引PVA形成氫鍵（圖3C、3D）。通過定義蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（DSSP）程序在100 ns的模擬中進一步分析兩種胰島素的二級結(jié)構(gòu)的演變，結(jié)果表明含有PVA分子的胰島素二級結(jié)構(gòu)分布保持穩(wěn)定，特別是對肽鏈的螺旋構(gòu)象結(jié)構(gòu)域的分布（圖3E、3F）。通過分子動力學(xué)證實微針材料可以通過氫鍵與IAsp和IDeg相互作用，但不會影響胰島素的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖3 PVA與胰島素相互作用研究

通過對微針施加軸向壓縮力（圖4A），并將微針插入活體動物皮膚，該研究分析了所制備微針的力學(xué)性能，包括斷裂強度和插入能力。微針的力-位移曲線顯示作用力持續(xù)增加，只導(dǎo)致微針彎曲而不斷裂（圖4B、4C）。皮膚插入試驗進一步證實載藥微針透皮應(yīng)用成功，在大鼠皮膚上產(chǎn)生的不可磨滅的穿刺部位（圖4D）以及表皮層內(nèi)的穿透腔（圖4E）。光學(xué)相干斷層掃描（OCT）圖像證實治療部位無皮膚病相關(guān)副作用，給藥60 min內(nèi)迅速恢復(fù)正常（圖4G、4H）。這些結(jié)果表明，該研究制備的負載胰島素微針足夠強，可以有效地插入皮膚，同時也具有良好的耐受性，不會引起皮膚問題。

圖4 負載胰島素微針的特性分析

OCT圖像顯示，負載IAsp和IDeg的微針可以在450μm~ 500 μm的深度有效穿透大鼠皮膚，隨后在與皮膚內(nèi)的間質(zhì)液接觸后溶解（圖5A）。應(yīng)用后，針尖在3 min內(nèi)溶解，大約一半的針高在5 min內(nèi)溶解在皮膚中（圖5B、5C），表明胰島素的釋放模式在很大程度上取決于基質(zhì)物質(zhì)的溶解。數(shù)據(jù)顯示，負載IAsp和IDeg的微針有相似的釋放趨勢，約80%的胰島素在前30 min內(nèi)釋放，在120 min內(nèi)達到水平斜率，證明胰島素的釋放模式在很大程度上依賴于基質(zhì)物質(zhì)的溶解（圖5D）。這些證據(jù)表明，含負載胰島素的微針在透皮應(yīng)用后迅速溶解，使有效載荷擴散到皮膚下，并被體循環(huán)吸收。

圖5 微針溶解動力學(xué)的體外研究

為了確定負載IAsp的微針對血糖管理的治療特性，在禁食條件下，將微針貼片給予鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病SD大鼠（圖6A）。在該方案中，糖尿病大鼠在微針治療前禁食6小時以上，僅篩選血糖水平超過16.7 mmol/L的大鼠，隨機分為微針治療組、SC注射組和安慰劑組（圖6B）。微針注射組和SC注射組的血糖水平在給藥30 min后均有顯著下降趨勢，并在1小時內(nèi)迅速下降到初始水平的20%左右（圖6C）。結(jié)果還表明，負載IAsp的微針在降糖給藥方面與皮下注射有相似的效果，可在短時間內(nèi)達到降糖目的。

圖6 負載IAsp的微針在禁食條件下治療糖尿病大鼠

在餐前給藥方案中，糖尿病大鼠在餐前0.5小時給予負載IAsp的微針貼片（微針組）、劑量匹配的SC IAsp（SC組）和PBS注射（安慰劑組）（圖7A1）。用負載IAsp的微針處理的大鼠在給藥后30 min內(nèi)血糖下降，隨后在進食后恢復(fù)到初始水平（圖7A2）。SC胰島素注射也表現(xiàn)出類似的低血糖趨勢，表明基于微針的胰島素給藥系統(tǒng)通常是精確、有效的。通過調(diào)整給藥/喂養(yǎng)方案，以改善餐后血糖管理。給藥時間保持在8:00、12:00和17:00，而每次給藥后立即給藥2g飼料（圖7B1)。

有效降低的血糖水平和維持長期的正常血糖證明，與餐前給藥方案相比，該方案表現(xiàn)出更好的IAsp作用和食物吸收的同步性（圖7B2），顯示了在減少餐后血糖振蕩和預(yù)防糖尿病后期并發(fā)癥方面的潛在適用性。食物攝入量增加的實驗大鼠表現(xiàn)出更明顯的日內(nèi)血糖波動和頻繁的高血糖（圖7C1、7C2）。血糖水平下降的第一個1小時治療后迅速反彈到高血糖狀態(tài)，證明胰島素劑量足以抵消膳食消費和覆蓋餐后血糖波動。因此，在未來負載胰島素微針的臨床應(yīng)用中，應(yīng)強調(diào)根據(jù)患者的特點量身定制治療策略。

圖7 負載IAsp的微針用于糖尿病大鼠的多餐方案

考慮到IDeg效應(yīng)的緩慢發(fā)作，所有組糖尿病大鼠在進食前1小時進行治療，并測量其血糖水平（圖8A）。與安慰劑組相比，微針組能夠控制餐后血糖的突然飆升，加上IDeg的漸進作用，血糖水平恢復(fù)到正常范圍（圖8B）。血糖水平統(tǒng)計數(shù)據(jù)的箱形圖顯示，實驗期間安慰劑組的平均值始終高于負載IDeg的微針組和IDeg注射組（圖8C）。安慰劑組大鼠的平均血糖水平在試驗期間逐漸升高，這意味著IDeg處理組的值也會升高（圖8D）。總的來說，用含IDeg的微針處理的大鼠血糖水平低于安慰劑組的大鼠，且隨著食物攝入量的增加而增加（圖8E）。對于餐前0小時測量的血糖水平，微針組下降到初始值的80%，顯著高于餐后2小時測量的血糖水平（圖8F），證實IDeg在基礎(chǔ)血糖控制方面的優(yōu)勢。應(yīng)用這種特性來指導(dǎo)基于微針的胰島素給藥系統(tǒng)，可以更好地管理糖尿病。

圖8 負載IDeg的微針用于糖尿病大鼠多餐方案

圖9顯示了操縱分子動力學(xué)過程中的拉拽距離與模擬時間之間的關(guān)系，這也有助于顯示IDeg單體之間更強的相互作用。

圖9 胰島素單體之間的拉距與時間的關(guān)系

綜上所述，在這項研究中，負載IAsp和IDeg的微針通過溫和的微成型工藝制備，并分別用于調(diào)節(jié)餐后和基礎(chǔ)血糖水平。CD試驗顯示，由于制備工藝簡單、溫和，微針包裹的胰島素在二級結(jié)構(gòu)中基本保持穩(wěn)定，可以防止胰島素活性成分失效，提供良好的降血糖效果。此外，分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明，微針材料可以通過氫鍵與IAsp和IDeg相互作用，但不會影響胰島素的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在不同喂養(yǎng)和給藥時間的糖尿病大鼠體內(nèi)試驗表明，制備的微針對降糖給藥的效果與皮下注射相似。負載IAsp的微針可以顯著降低糖尿病大鼠血糖水平，給藥后1 ~ 2小時內(nèi)達到最大療效，并能夠維持血糖控制3 ~ 4小時，使其適合定時用藥，以更好地同步IAsp作用和食物吸收。負載IDeg的微針不僅能減少餐后血糖波動，而且還延長治療效果的持續(xù)時間，減少日間血糖波動，預(yù)防并發(fā)癥。

這項工作集中在研究負載IAsp和IDeg的微針在空腹和不同飲食條件下的降糖作用，以及使用胰島素-微針系統(tǒng)治療的糖尿病患者餐后血糖偏移和食物攝入量之間的關(guān)系，為評估負載IAsp和IDeg的微針作為基礎(chǔ)方案治療日常糖尿病的可行性提供新的信息。未來的工作可能集中在開發(fā)IAsp/IDeg混合微針，以提供更長時間的基礎(chǔ)胰島素和簡化的基礎(chǔ)方案，以更好的治療糖尿病。

審核編輯：劉清