利用各種合成生物學(xué)工具和方法進(jìn)行微生物工程已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。然而，將DNA導(dǎo)入非模型新型底盤生物，特別是那些未定性的生物，仍然是推進(jìn)該領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展的主要障礙。有幾種常用的將DNA導(dǎo)入微生物的有效方法，包括化學(xué)感受態(tài)、原生質(zhì)體、電穿孔和大腸桿菌介導(dǎo)的共軛。然而，這些方法只適用于少數(shù)馴化的底盤微生物，因此限制了可作為合成生物學(xué)宿主細(xì)胞的微生物范圍。

為了解決這一障礙，Brophy 等人開發(fā)了一種基于廣泛宿主共軛的DNA轉(zhuǎn)移工具，名為XPORT（圖1）。在這種方法中，包括枯草芽孢桿菌內(nèi)源性整合與共軛元件（ICE）在內(nèi)的共軛機(jī)制被設(shè)計(jì)用于將基因回路可控地傳遞到非傳統(tǒng)和未馴化的底盤細(xì)菌中。雖然XPORT為非馴化細(xì)菌工程學(xué)引入了一種前景廣闊的方法，但其廣泛和實(shí)際應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先，XPORT介導(dǎo)的共軛需要DNA供體細(xì)胞和受體細(xì)胞直接物理接觸，以促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)移，因此供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的比例通常必須相當(dāng)高（>10?：1），才能確保成功。其次，共軛效率取決于供體細(xì)胞與受體細(xì)胞的比例以及共培養(yǎng)時(shí)間，這需要通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳 DNA轉(zhuǎn)移條件，這非常耗時(shí)耗力。最后，XPORT介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移方法僅適用于某些細(xì)菌物種，特別是那些具有與供體菌株相似的遺傳背景的物種。對(duì)于其他物種，可能需要對(duì)XPORT系統(tǒng)進(jìn)行修改或開發(fā)新的系統(tǒng)。

圖1 XPORT介導(dǎo)的共軛原理示意圖

為解決上述挑戰(zhàn)，近期，美國(guó)作戰(zhàn)能力發(fā)展司令部陸軍研究實(shí)驗(yàn)室（DEVCOM ARL）的研究人員開發(fā)了一種名為DNA ENTRAP的液滴微流控平臺(tái)，用于增強(qiáng)工程枯草芽孢桿菌（XPORT）介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究以“XPORT ENTRAP: A droplet microfluidic platform for enhanced DNA transfer between microbial species”為題，發(fā)表在New Biotechnology期刊上。

圖2基于液滴微流控技術(shù)的DNA轉(zhuǎn)移工作流程

液滴微流控平臺(tái)通過(guò)將供體和受體細(xì)胞封裝在微小的油包水乳液液滴中，使得細(xì)胞之間距離更近。這種物理上的接近增加了成功共軛的潛力，從而提高了基因轉(zhuǎn)移的速率。此外，該平臺(tái)允許對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行精確控制（例如供體-受體細(xì)胞比例和共培養(yǎng)時(shí)間），通過(guò)優(yōu)化這些參數(shù)，可以最大化DNA轉(zhuǎn)移的效率，減少實(shí)驗(yàn)的時(shí)間和資源消耗。其次，微液滴內(nèi)部呈現(xiàn)混沌對(duì)流特性，下游的蛇形混合模塊通過(guò)增加流體的混合程度進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)部的混合，提高了細(xì)胞間接觸的機(jī)會(huì)并擴(kuò)大了接觸面積，有利于基因的成功轉(zhuǎn)移。此外，該平臺(tái)具有自動(dòng)化特性，可以進(jìn)行高通量實(shí)驗(yàn)和篩選。自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)流程有利于大幅提高實(shí)驗(yàn)效率，同時(shí)減少操作失誤的可能性，從而增強(qiáng)DNA轉(zhuǎn)移的效率。研究人員使用枯草桿菌測(cè)試了這種微流控DNA ENTRAP系統(tǒng)與傳統(tǒng)臺(tái)式XPORT共軛方案相比的可行性和效率。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XPORT介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移比目前的臺(tái)式XPORT過(guò)程更強(qiáng)。

圖3 兩種不同供體與受體細(xì)胞比例下的液滴內(nèi)DNA共軛與臺(tái)式系統(tǒng)共軛效率的比較

綜上所述，該研究開發(fā)的DNA ENTRAP液滴微流控平臺(tái)為實(shí)現(xiàn)XPORT介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程的簡(jiǎn)化和自動(dòng)化以及未來(lái)的高通量細(xì)胞工程和篩選應(yīng)用鋪平了道路。它有可能提高我們對(duì)各種微生物進(jìn)行基因改造的能力，并迅速加速馴化這些尚未開發(fā)的微生物，以用于廣泛的生物技術(shù)和生物制造應(yīng)用。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.nbt.2024.02.003

審核編輯：劉清