近日，浙江大學(xué)方群團隊聯(lián)合北京大學(xué)黃超蘭團隊在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究領(lǐng)域取得了突破性進展。此項成果近日以全文形式在線發(fā)表于美國化學(xué)會的Analytical Chemistry雜志上(影響因子6.32)，論文題目為“Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis”。

圖：納升級油-氣-液滴(OAD)芯片和自動定位(SAM)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖(a)和用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析的樣品前處理和上樣的全流程圖(b)。

蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組計劃之一，也是近年來的熱點研究領(lǐng)域。作為生命體內(nèi)功能直接執(zhí)行者的蛋白質(zhì)，和基因相比在揭示生命發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展的機制方面有更重大的意義。近年來，基于細(xì)胞群體內(nèi)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，因為不可避免地會將大量細(xì)胞內(nèi)的信息平均化，已經(jīng)越來越難以滿足對生命功能更加深入探究的需要。從單細(xì)胞層面去了解細(xì)胞特征以及彼此之間的相互影響，可以為生物系統(tǒng)中細(xì)胞間的異質(zhì)性提供更寶貴的信息，因此有著越來越大的迫切需求。鑒于蛋白質(zhì)不具有直接擴增的特性，以及蛋白質(zhì)組學(xué)分析靈敏度的限制，目前對于少量乃至單細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的檢測在技術(shù)上還是極具挑戰(zhàn)的。

單細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量極少，就典型體細(xì)胞而言僅為0.1- 0.2 ng，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理所需要的微克級蛋白量。并且細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)通常需要在離心管內(nèi)完成復(fù)雜多步的前處理操作，包括細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)釋放、蛋白質(zhì)沉淀純化、蛋白質(zhì)還原和烷基化、酶切等，一個全細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)組的最后反應(yīng)體積均是幾十甚至過百微升，在這個蛋白質(zhì)組學(xué)常規(guī)前處理的過程中，由于樣品與離心管的接觸、多步的樣品轉(zhuǎn)移和不完全上樣等原因，在進入質(zhì)譜之前不可避免地帶來了蛋白質(zhì)的損失。用此流程來處理單細(xì)胞，即使之后結(jié)合液相色譜儀器的自動進樣閥可以以小于十微升的體積完成上樣也無濟于事，因為尚未等到分離蛋白質(zhì)樣品就有可能已經(jīng)損失大半了。

如果說單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)是在米粒上雕刻，那么兩個團隊就是造出了適合在米粒上雕刻的工具刀。該項研究起自2014年，兩個團隊的研究人員協(xié)同合作將微流控液滴技術(shù)與蛋白質(zhì)組分析技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了一種微型化的油-氣-液“三明治”芯片及相應(yīng)的納升級液體操控和進樣方法，能夠在原位靜態(tài)的納升級液滴中完成少量細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析所必需的多步樣品前處理操作，并且實現(xiàn)了將液滴樣品直接高效地注入到色譜分析柱內(nèi)完成后續(xù)的液相色譜分離與質(zhì)譜檢測。通過采用優(yōu)化后的芯片材料、裂解試劑、酶切比例和色譜質(zhì)譜參數(shù)等實驗條件，該芯片系統(tǒng)可以分別成功地從100、50、10和1個HeLa細(xì)胞內(nèi)鑒定到1360、612、192和51個蛋白質(zhì)。更重要的是，研究人員首次實現(xiàn)了以單個鼠卵母細(xì)胞為初始樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，一共鑒定到355種蛋白質(zhì)，其中存在一系列與生殖發(fā)育(Ovgp1和Pabpc1)、疾病相關(guān)(AnxA6，Kpna2，Cct6a和Pcbp2)的基因。在該工作中，還采用兩種常規(guī)的基于離心管的前處理方法進行了對照實驗，實驗結(jié)果明確證實了微流控液滴體系具有更低的樣品吸附損失、更高的酶切效率和更高效的疏水性蛋白質(zhì)鑒定能力等明顯優(yōu)勢，更適用于微量蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

此項研究帶來三個突破：首先是成功發(fā)展了適合進行單細(xì)胞及類似微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析樣品前處理芯片和方法。芯片內(nèi)550 納升的液滴與芯片的接觸面積僅為常規(guī)離心管模式下的十五分之一，顯著減少了樣品與反應(yīng)器接觸所帶來的損失；二是發(fā)展了一種實現(xiàn)納升級液滴的直接進樣方法，利用3D打印加工的自動定位裝置和高壓氣泵高效地(> 99%)將液滴樣品注入到分析色譜柱內(nèi)，完全避免了樣品轉(zhuǎn)移和經(jīng)過液相儀器內(nèi)復(fù)雜管路帶來的損失；第三是為避免在常規(guī)微流控液滴系統(tǒng)中由于油相直接接觸液滴而造成的缺陷，提出了一種采用氣相來間隔液滴相和油相的新型液滴芯片結(jié)構(gòu)，在成功防止液滴明顯蒸發(fā)的同時，還避免了油相和液滴相直接接觸帶來的脂溶性樣品的損失，也使系統(tǒng)能更方便地進行后續(xù)的分離柱進樣、色譜分離和質(zhì)譜檢測。

該項研究在基于質(zhì)譜的單細(xì)胞及微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方面開啟了全新的技術(shù)，其所具有的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、容易搭建、操作方便、可靠性高等特點，使其有望被廣泛應(yīng)用到細(xì)胞間異質(zhì)性的研究以及與臨床相關(guān)的研究，包括稀有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析、生殖細(xì)胞相關(guān)研究和疾病診療等方面，因此在未來具有巨大的持續(xù)開發(fā)和應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景。

（左上：浙江大學(xué)教授方群、右上：北京大學(xué)教授黃超蘭、左下：浙江大學(xué)博士生李紫藝、右下：前國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心·上海高級工程師黃敏）

該論文的第一作者為浙江大學(xué)博士生李紫藝，通訊作者為浙江大學(xué)化學(xué)系微分析系統(tǒng)研究所方群教授和北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部精準(zhǔn)醫(yī)療多組學(xué)研究中心主任黃超蘭教授。工作得到了國家自然科學(xué)基金和中國科學(xué)院杰出技術(shù)人才項目的支持。黃超蘭教授的部分工作在前單位中科院國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心·上海完成，特此鳴謝!