與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的低豐度生物標(biāo)志物的超靈敏、多指標(biāo)檢測(cè)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大需求，但目前常用的檢測(cè)技術(shù)往往無(wú)法在單管檢測(cè)中同時(shí)實(shí)現(xiàn)多重生物標(biāo)志物的精準(zhǔn)鑒別和高靈敏檢測(cè)。新興的基于隔離分區(qū)模式的數(shù)字式生物檢測(cè)平臺(tái)雖能達(dá)到超高的檢測(cè)靈敏度，但受限于熒光檢測(cè)通道的數(shù)量與鑒別目標(biāo)分子的編碼方式，無(wú)論是核酸樣本還是蛋白樣本，單管反應(yīng)中檢測(cè)的目標(biāo)分子種類均不超過(guò)10重。因此，如何在單管多重指標(biāo)鑒別的同時(shí)實(shí)現(xiàn)超高靈敏檢測(cè)是目前生物檢測(cè)領(lǐng)域中極具挑戰(zhàn)的瓶頸問(wèn)題。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，針對(duì)上述亟待突破的關(guān)鍵問(wèn)題，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院古宏晨/徐宏團(tuán)隊(duì)聚焦可快速生成無(wú)限量分區(qū)的高通量液滴微流控平臺(tái)，采用團(tuán)隊(duì)獨(dú)創(chuàng)的編碼微球載體，構(gòu)建了新型“編碼微球-液滴”基微流控芯片，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了“蛋白-核酸”通用型超靈敏數(shù)字式生物檢測(cè)技術(shù)。創(chuàng)新地實(shí)現(xiàn)了：（1）單個(gè)液滴對(duì)單個(gè)編碼微球的裝載率突破傳統(tǒng)“泊松分布”的限制，極大提高了數(shù)字式生物檢測(cè)的分析效率與檢測(cè)通量；（2）多重蛋白和核酸分子在編碼微球載體表面的單分子高效捕獲、“單微球-單分子”待檢編碼信號(hào)的準(zhǔn)確鑒別、單分子靶標(biāo)信號(hào)放大與單分子檢測(cè)。

高效單編碼微球封裝的液滴微流控系統(tǒng)

在傳統(tǒng)的液滴分區(qū)中，利用熒光編碼微球作為鑒別、捕獲靶分子的載體，雖可大幅提高檢測(cè)重?cái)?shù)與通量，但受限于泊松分布，液滴分區(qū)對(duì)單個(gè)微球的封裝完全隨機(jī)，通常僅有10%以下的分區(qū)為含有1個(gè)編碼微球的有效液滴，90%的液滴為未封裝編碼微球的空液滴。這些冗余的空液滴會(huì)在后續(xù)的檢測(cè)分析中造成分析資源的大量浪費(fèi)。因此，基于“編碼微球-液滴”的多重?cái)?shù)字式檢測(cè)方法學(xué)需要解決的首要問(wèn)題是如何突破泊松分布的限制，讓有且僅有一個(gè)編碼微球的液滴分區(qū)比例大幅提高。針對(duì)此問(wèn)題，該團(tuán)隊(duì)提出了一種集微球排列、液滴生成與微球包裹的集成式“編碼微球-液滴”微流控芯片（bead ordered arrangement droplet system，BOAD）系統(tǒng)。首先利用巧妙的流體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，在短至1cm的微流道中實(shí)現(xiàn)微球的快速有序排列，進(jìn)而將有序排列的微球一一封裝入液滴。研究結(jié)果顯示，BOAD系統(tǒng)可將包裹有單個(gè)編碼微球的液滴分區(qū)比例大幅提升至86%，單個(gè)微球的封裝效率是常規(guī)檢測(cè)體系的9倍。進(jìn)一步地，該研究還展示了54重編碼微球的高效包裹與精準(zhǔn)解碼。最后，采用IL-10為模式待測(cè)分子，證明了構(gòu)建的BOAD系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)超靈敏的數(shù)字式檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度較傳統(tǒng)流式免疫熒光提高500倍。上述結(jié)果均展示了BOAD系統(tǒng)在多重?cái)?shù)字式超敏檢測(cè)與單細(xì)胞分析等領(lǐng)域的強(qiáng)大應(yīng)用潛力。

圖1 課題組提出的高效單微球封裝的液滴微流控系統(tǒng)

“編碼微球-液滴”基多重?cái)?shù)字ELISA超敏檢測(cè)系統(tǒng)

靈敏度到亞fM級(jí)別（fg/mL）的超靈敏、多重?cái)?shù)字酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)技術(shù)在基礎(chǔ)生命科學(xué)研究和臨床應(yīng)用等方面（如腫瘤早篩、阿爾茲海默病血液基標(biāo)志物的檢測(cè)等）都具有重要的意義。該團(tuán)隊(duì)基于液滴微流控平臺(tái)，以自主設(shè)計(jì)開發(fā)的新型熒光編碼微球作為識(shí)別不同蛋白分子的載體，創(chuàng)新性地開發(fā)了一種兼具通用性與實(shí)用性的多重?cái)?shù)字ELISA技術(shù)。首先，針對(duì)如何在直徑幾十微米的pL級(jí)液滴中實(shí)現(xiàn)直徑僅幾微米的編碼微球精準(zhǔn)解碼難題，團(tuán)隊(duì)提出采用短、長(zhǎng)曝光時(shí)間的二次成像方法，顯著提高編碼微球在液滴中的解碼精度，為超高重蛋白分子的多重?cái)?shù)字式檢測(cè)提供可靠的檢測(cè)平臺(tái)。其次，針對(duì)pL液滴的單分子信號(hào)準(zhǔn)確、快速檢出問(wèn)題，采用酶信號(hào)放大單元作為酶標(biāo)記物，快速實(shí)現(xiàn)單個(gè)待測(cè)分子的信號(hào)放大，僅需5min即可實(shí)現(xiàn)“1”和“0”液滴的區(qū)分與準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，顯著縮短檢測(cè)時(shí)間。最后，以TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-17A、IL-10等5種細(xì)胞因子為模式待測(cè)分子，在構(gòu)建的“編碼微球-液滴”微流控芯片上成功實(shí)現(xiàn)了單管多重蛋白的數(shù)字式檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度較傳統(tǒng)的多重懸浮芯片技術(shù)提升了100+~10000+倍。該工作證明了“編碼微球-液滴”基微流控技術(shù)有望成為臨床超敏蛋白檢測(cè)新的解決方案。

圖2 “編碼微球-液滴”基多重?cái)?shù)字ELISA超敏檢測(cè)系統(tǒng)

“編碼微球-液滴”基多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng)

多重?cái)?shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）受到臨床應(yīng)用與基礎(chǔ)生命科學(xué)研究等領(lǐng)域的日益關(guān)注。然而，當(dāng)前的多重?cái)?shù)字PCR技術(shù)缺乏兼具高靈敏度、高信噪比和超高多重靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的有效策略?；诖?，該團(tuán)隊(duì)提出了一種基于熒光編碼微球的液滴基多重?cái)?shù)字PCR超敏檢測(cè)方法（Bead-based multiplexed droplet digital PCR）。該方法采用團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的超高編碼容量熒光編碼微球作為不同核酸的鑒別載體，從而大幅提升檢測(cè)重?cái)?shù)；進(jìn)而結(jié)合通用引物與通用探針序列的巧妙設(shè)計(jì)，在“編碼微球-液滴”微流控平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)高信噪比、超靈敏的多重核酸檢測(cè)。在該方法中，以新型冠狀病毒相關(guān)的orf1ab和N基因、甲型流感、乙型流感各自保守區(qū)基因以及陽(yáng)控質(zhì)粒作為模式待測(cè)靶標(biāo)，通過(guò)預(yù)富集在不同靶基因上分別引入完全相同的通用序列；再利用固定有特異性探針的熒光編碼微球，對(duì)富集后的不同核酸分子進(jìn)行單分子特異性捕獲，形成“單個(gè)編碼微球-單個(gè)核酸分子”雜交復(fù)合物；最后，將上述微球雜交復(fù)合物包裹進(jìn)含有通用擴(kuò)增引物和通用熒光水解探針的液滴中，進(jìn)行單反應(yīng)多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)。該方法在流感病毒和新型冠狀病毒的五重聯(lián)檢中可實(shí)現(xiàn)接近單分子級(jí)別的檢測(cè)靈敏度，信噪比高且無(wú)交叉反應(yīng)，為超高重?cái)?shù)和超靈敏度的多重?cái)?shù)字PCR技術(shù)奠定了基礎(chǔ)，具有實(shí)際臨床應(yīng)用的潛力。

圖3 “編碼微球-液滴”基多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng)