新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是由國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)指定的“嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型”病毒（SARS-CoV-2）引起的。由于這種病毒具有高度傳染性，可導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病，進(jìn)而引起死亡，世界衛(wèi)生組織（WHO）于2020年3月11日將COVID-19疫情列為大流行。在大流行中，提供快速、準(zhǔn)確和便捷的診斷方法來(lái)檢測(cè)感染和監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)，對(duì)于治療、減輕、控制和管理疾病的傳播至關(guān)重要。

目前，用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)SARS-CoV-2感染的主要實(shí)驗(yàn)室診斷工具可分為以下幾類(lèi)：（1）識(shí)別病毒RNA的工具；（2）檢測(cè)病毒抗原的工具；（3）檢測(cè)病毒感染時(shí)體液反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體的工具。其中，利用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)病毒RNA是診斷活動(dòng)性感染的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，該技術(shù)容易受到樣本處理問(wèn)題和病毒突變的影響，從而可能分別導(dǎo)致假陽(yáng)性和假陰性的檢測(cè)結(jié)果。而抗原檢測(cè)是通過(guò)對(duì)病毒中存在的蛋白質(zhì)（如N和S蛋白）進(jìn)行免疫檢測(cè)，以確定活動(dòng)性感染?；趥?cè)向流動(dòng)檢測(cè)的快速抗原檢測(cè)因具有易于使用、價(jià)格低廉、可在5-30分鐘內(nèi)提供檢測(cè)結(jié)果的優(yōu)勢(shì)，已成為COVID-19即時(shí)診斷的代名詞。然而，與RT-PCR相比，快速抗原檢測(cè)的靈敏度較低。

與以上兩種方法對(duì)應(yīng)，抗體或血清學(xué)檢測(cè)方法用于檢測(cè)人體內(nèi)是否存在SARS-CoV-2抗體。由于抗體是由免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞對(duì)病毒感染做出反應(yīng)而產(chǎn)生的，陽(yáng)性的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明人體在過(guò)去或當(dāng)下受到了病毒感染。此外，這些檢測(cè)可以幫助減少假陽(yáng)性和假陰性檢測(cè)結(jié)果的數(shù)量，是病毒RNA和病毒抗原檢測(cè)的重要補(bǔ)充。事實(shí)上，血清學(xué)檢測(cè)相比病毒RNA和抗原檢測(cè)有一些優(yōu)勢(shì)，比如檢測(cè)窗口更長(zhǎng)；并且與病毒RNA相比，人體抗體更穩(wěn)定；另外，采集血液比采集呼吸道樣本更安全；同時(shí)，血液中的抗體比呼吸道樣本中的病毒分布更均勻；且血清學(xué)檢測(cè)不需要在生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。此外，抗體檢測(cè)在診斷涉及病毒RNA檢測(cè)陰性或無(wú)癥狀感染的疑似病例以及在群體水平進(jìn)行接觸者追蹤、疫情發(fā)展監(jiān)測(cè)、病毒來(lái)源追蹤和流行病學(xué)評(píng)估等方面發(fā)揮著重要作用；這些檢測(cè)還在監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)以評(píng)估免疫的進(jìn)程、程度和持久性，確定處于康復(fù)期的潛在獻(xiàn)血人員，開(kāi)發(fā)和評(píng)估治療性抗體，以及開(kāi)發(fā)和評(píng)估疫苗方面發(fā)揮作用。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，來(lái)自加拿大阿爾伯塔大學(xué)（University of Alberta）的研究人員于Microsystems & Nanoengineering期刊發(fā)表了題為“Label-free impedimetric immunosensor for point-of-care detection of COVID-19 antibodies”的論文，提出了一種基于叉指微電極陣列（IMA）的阻抗免疫傳感器，用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)人體血清中的SARS-CoV-2抗體。該傳感器利用化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)將SARS-CoV-2的刺突蛋白（S蛋白）功能化并共價(jià)固定在IMA表面，作為識(shí)別層，以特異性結(jié)合抗刺突抗體。而抗體與識(shí)別層S蛋白的結(jié)合將導(dǎo)致電容增加，從而引起傳感系統(tǒng)阻抗的變化。

圖1 叉指微電極陣列（IMA）表面功能化和刺突蛋白固定化示意圖

其中，該基于電化學(xué)阻抗譜（EIS）的生物傳感器中的檢測(cè)信號(hào)可以來(lái)自法拉第過(guò)程或非法拉第過(guò)程。在基于法拉第過(guò)程的生物傳感器中，由于系統(tǒng)中氧化還原試劑的氧化還原反應(yīng)，檢測(cè)信號(hào)來(lái)自IMA上的界面電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)。在這個(gè)過(guò)程中，氧化還原試劑是必需的，同時(shí)傳感系統(tǒng)中的輸入電壓必須高于氧化還原試劑的氧化還原電位。而基于非法拉第過(guò)程的生物傳感器的檢測(cè)信號(hào)來(lái)自于IMA電極-溶液界面識(shí)別層中選擇性抗原-抗體結(jié)合導(dǎo)致的界面層電容和電阻的變化。因此，基于非法拉第過(guò)程的傳感系統(tǒng)是無(wú)標(biāo)記的，需要低無(wú)擾動(dòng)電壓，因而適用于即時(shí)診斷（POC）應(yīng)用。

基于非法拉第過(guò)程傳感系統(tǒng)的檢測(cè)原理如圖1所示，當(dāng)IMA中的電極和電極間隙分別被巰基-十一醇（MUOH）和氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）功能化時(shí)，斯特恩（Stern）層和擴(kuò)散層通過(guò)形成自組裝單分子層（SAM）而被推離電極表面。SAM的進(jìn)一步功能化和隨后的刺突蛋白固定化導(dǎo)致識(shí)別層的形成，這使得傳感器能夠選擇性地結(jié)合和檢測(cè)COVID-19抗體。

眾所周知，電容式生物傳感器的靈敏度低于法拉第式生物傳感器。提高電容式生物傳感器靈敏度的一個(gè)巧妙方法是降低EIS測(cè)量中使用的溶液的離子強(qiáng)度。為了深入了解離子強(qiáng)度對(duì)器件靈敏度的影響，研究人員以檢測(cè)抗S蛋白抗體（IgG、IgM和IGA）為例，利用MUOH和APTES修飾的IMA，通過(guò)測(cè)量含有1 x PBS和0.001 x PBS的溶液中的阻抗來(lái)研究器件的性能。結(jié)果表明，當(dāng)在1 x PBS溶液中進(jìn)行阻抗測(cè)量時(shí)，該器件表現(xiàn)出相對(duì)較低的靈敏度；而在0.001 x PBS溶液中測(cè)得的低頻區(qū)檢測(cè)信號(hào)的幅值遠(yuǎn)大于在1 x PBS溶液中測(cè)得的相應(yīng)值。顯然，該結(jié)果表明，通過(guò)調(diào)節(jié)介質(zhì)的離子強(qiáng)度，可以顯著提高阻抗免疫傳感器的靈敏度，這與理論上預(yù)測(cè)的電場(chǎng)的距離依賴(lài)性一致。

圖2 無(wú)標(biāo)記生物傳感器對(duì)抗體與固定在阻抗免疫傳感器識(shí)別層上的三聚體刺突蛋白選擇性結(jié)合過(guò)程進(jìn)行基于非法拉第過(guò)程的EIS測(cè)量示意圖

圖3 生物傳感器靈敏度對(duì)用于非法拉第過(guò)程EIS測(cè)量的傳感介質(zhì)離子強(qiáng)度的依賴(lài)關(guān)系

此外，根據(jù)利用世界衛(wèi)生組織國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（WHO IS）制定的用于抗新冠病毒免疫球蛋白檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的結(jié)果，該器件的檢測(cè)限（LOD）為0.4 BAU/ml，該LOD與所有已驗(yàn)證和已建立的商業(yè)檢測(cè)報(bào)告的相應(yīng)LOD（范圍為0.41 ~ 4.81 BAU/ml）相似。另外，這種概念驗(yàn)證型生物傳感器已被證明可以在1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到COVID-19感染者血清中的抗刺突抗體。

圖4 無(wú)標(biāo)記非法拉第EIS生物傳感器檢測(cè)新冠病毒抗體的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線及其與其他生物傳感器的性能比較

綜上所述，在這項(xiàng)工作中，研究人員開(kāi)發(fā)了一種無(wú)標(biāo)記阻抗電容式免疫傳感器，該傳感器能夠清晰地區(qū)分COVID-19陽(yáng)性和COVID-19陰性的人血清樣本，具有良好的靈敏度和特異性。該文介紹的非法拉第阻抗檢測(cè)采用低無(wú)擾動(dòng)電壓，不需要標(biāo)記或添加傳感試劑，與ELISA不同，該方法不需要酶標(biāo)記的二抗、底物以及相應(yīng)的孵育時(shí)間。因此，無(wú)標(biāo)記阻抗免疫傳感器本質(zhì)上需要比ELISA更短的孵育時(shí)間，未來(lái)有望用于快速診斷檢測(cè)。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41378-022-00460-5

審核編輯 ：李倩