成像技術(shù)對(duì)于破譯各種空間尺度的生物現(xiàn)象、結(jié)構(gòu)和機(jī)制至關(guān)重要。傳統(tǒng)成像方式的空間分辨率不能滿足生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域高精度研究和診斷的需求。等離激元共振是光與物質(zhì)的相互作用，它使遠(yuǎn)場(chǎng)輻射聚焦到近場(chǎng)，形成局域化的強(qiáng)電磁場(chǎng)，增強(qiáng)了納米消融、吸附物的彈性/非彈性散射和附近熒光體的光致發(fā)光發(fā)射。

此外，納米粒子的等離激元共振散射可以靈敏地反應(yīng)微環(huán)境的變化。將等離激元的高空間分辨能力與拉曼、紅外、熒光等分子光譜分析技術(shù)相結(jié)合，可以發(fā)展出一系列優(yōu)秀的成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)從組織到亞細(xì)胞水平的各種生物過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

近期，廈門大學(xué)李劍鋒教授與廈門大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院王焱教授從空間分辨率的角度綜述了一系列等離激元技術(shù)的原理，并展開論述其在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域的應(yīng)用。相關(guān)成果以“Advanced plasmonic technologies for multi-scale biomedical imaging”為題發(fā)表在國際化學(xué)權(quán)威雜志Chemical Society Reviews上。



圖1 不同尺度空間分辨等離激元技術(shù)在生物成像中的應(yīng)用

等離激元光子學(xué)的基礎(chǔ)

圖2 等離激元的機(jī)理和現(xiàn)象

作者首先簡(jiǎn)要介紹了等離激元光子學(xué)的基本概念，并強(qiáng)調(diào)了局域等離激元共振效應(yīng)（LSPR）的納米尺度的特點(diǎn)，引申介紹了三個(gè)LSPR相關(guān)的現(xiàn)象：

（1）金屬表面附近的電磁場(chǎng)增強(qiáng)。在局部等離激元共振狀態(tài)下，電磁場(chǎng)延伸到周圍大約10 nm-30 nm，因此，它只能影響附近的物體，例如，增強(qiáng)表面吸附分子的拉曼（非彈性）散射，增強(qiáng)金屬附近熒光團(tuán)的熒光發(fā)射，以及在納米區(qū)域消融/電離樣品。這種局部的電磁場(chǎng)使得探測(cè)納米區(qū)域的信號(hào)成為可能。

（2）納米結(jié)構(gòu)的加熱效應(yīng)。一旦局部表面等離激元被激發(fā)，吸收的能量就會(huì)誘導(dǎo)金屬的電子從基態(tài)轉(zhuǎn)移到高能態(tài)，產(chǎn)生熱載流子。一小部分熱載流子通過光致發(fā)光或能量轉(zhuǎn)移到周圍介質(zhì)而衰變。而大多數(shù)作為阻尼振蕩器，通過電子-光子、電子-電子和電子-聲子的耦合進(jìn)行非輻射衰減，導(dǎo)致局部熱效應(yīng)。這種熱能可以作為納米級(jí)的熱源用于光熱解吸、光熱治療和材料合成。

（3）納米結(jié)構(gòu)奇特的散射和吸收效應(yīng)。當(dāng)納米粒子中電子振蕩的頻率與入射光的頻率相吻合時(shí)，入射光子就會(huì)發(fā)生顯著的消光，包括散射和吸收，因此納米粒子溶液顯示出獨(dú)特的顏色。不同尺寸的納米粒子表現(xiàn)出不同的吸收/散射行為。吸收/散射譜圖的變化反應(yīng)了納米粒子之間以及納米粒子與周圍環(huán)境的相互作用，這為埃級(jí)距離變化的傳感提供了一種有效方式。

LSPR提供了適合于納米尺度成像的超敏感分析方法。上述增強(qiáng)的拉曼和熒光效應(yīng)可以衍生為表面增強(qiáng)的拉曼散射光譜（SERS）和針尖增強(qiáng)的拉曼/熒光光譜（TERS/TEFS）。等離激元材料的增強(qiáng)電磁場(chǎng)和加熱效應(yīng)可以發(fā)展為針尖增強(qiáng)的燒蝕和電離質(zhì)譜（TEAI-MS）。彈性散射可以發(fā)展為散射型掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡（s-SNOM）和等離激元尺。因此，接下來，該綜述從空間分辨率的角度（即從微米到埃級(jí)的分辨率），敘述了以上技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)成像中的應(yīng)用。

SERS生物成像：從微米到納米的分辨率

自1970年代發(fā)明以來，SERS技術(shù)由于其超靈敏和抗干擾能力而被廣泛用于生物成像和生物感應(yīng)。目前有三種基于納米結(jié)構(gòu)的SERS檢測(cè)方法：直接SERS成像、基于反應(yīng)的SERS成像和標(biāo)簽式SERS成像（圖3a-c）。根據(jù)SERS生物成像的模式，空間分辨率從微觀到納米不等。所有這些SERS檢測(cè)方法都可以適應(yīng)普通的基于激光的光學(xué)系統(tǒng)，以獲得由點(diǎn)掃描、線掃描或面掃描逐像素收集的光譜集產(chǎn)生的SERS圖像。SERS成像的空間分辨率通常受到遠(yuǎn)場(chǎng)衍射極限的限制。

SERS成像可以用于研究細(xì)胞外、細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的單細(xì)胞生物學(xué)過程（圖4）。比如用增強(qiáng)基底對(duì)細(xì)胞外pH進(jìn)行成像，利用SERS-標(biāo)簽策略監(jiān)測(cè)葉酸與其細(xì)胞表面受體之間的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，以及用超窄的納米間隙SERS編碼標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的細(xì)胞器成像。

圖3 SERS生物成像的模式

SERS技術(shù)還適用于組織水平的可視化、診斷和疾病的預(yù)后，如腫瘤和缺血性壞死（圖4）。SERS基底已經(jīng)成為一種探測(cè)組織切片和高靈敏化學(xué)成像的表征手段。比如用金納米珊瑚增強(qiáng)基底獲取生物切片的獨(dú)特拉曼帶，實(shí)現(xiàn)缺血區(qū)和正?？刂茀^(qū)的顯著區(qū)分。

進(jìn)一步，經(jīng)過保護(hù)性殼層修飾的SERS標(biāo)簽粒子可以用于圖像引導(dǎo)的外科腫瘤切除和熱成像引導(dǎo)的微腫瘤消融。另外，將SERS標(biāo)簽與近紅外-II熒光相結(jié)合，可以提供了一個(gè)雙模式跟蹤平臺(tái)，以評(píng)估體內(nèi)化學(xué)分布和標(biāo)記的干細(xì)胞的動(dòng)態(tài)。這種標(biāo)記和多模態(tài)追蹤系統(tǒng)在不同器官疾病的治療方面具有巨大的潛力。

上述細(xì)胞級(jí)成像應(yīng)用主要受遠(yuǎn)場(chǎng)衍射的限制，分辨率在微米/亞微米的量級(jí)。而超分辨率SERS成像擴(kuò)展了納米級(jí)成像的可能性，同時(shí)還可以獲得豐富的光譜信息（圖3e-i）。為了實(shí)現(xiàn)打破衍射極限的更高空間分辨率，可以采用獨(dú)特的超分辨率方法（STORM）來獲取和處理信號(hào)。

SERS超分辨率成像借鑒于單分子熒光成像技術(shù)：當(dāng)個(gè)別分子擴(kuò)散進(jìn)入或者離開納米粒子間隙形成的熱點(diǎn)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致SERS強(qiáng)度隨時(shí)間發(fā)生波動(dòng)（表現(xiàn)為在微秒或毫秒尺度的寬場(chǎng)圖像中的光閃爍現(xiàn)象）。因此可以利用熱點(diǎn)的這一特征，實(shí)現(xiàn)單個(gè)分子的SERS散射信號(hào)在“開”和“關(guān)”狀態(tài)之間的不斷切換。

通過SERS-STORM超分辨技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了針對(duì)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的化學(xué)成像，圖像分辨率小于50 nm。需要指出的是為了獲得具有納米級(jí)分辨率的生物樣本的SERS超分辨全景成像，通常還需要高密度和大面積的熱點(diǎn)，作為納米級(jí)的激發(fā)源，隨機(jī)“照亮”生物樣本表面的分子。

圖4 SERS細(xì)胞成像和組織成像的應(yīng)用

針尖增強(qiáng)的燒蝕和電離質(zhì)譜成像：亞微米級(jí)的分辨率

盡管二次離子質(zhì)譜（SIMS）可以提供納米級(jí)分辨率的化學(xué)成像，但它受到光譜干擾、基質(zhì)效應(yīng)和質(zhì)量范圍的限制。若將近場(chǎng)技術(shù)引入質(zhì)譜分析，質(zhì)譜成像（MSI）的空間分辨率可以達(dá)到亞微米級(jí)甚至納米級(jí)。研究人員通過引入一個(gè)納米級(jí)的無孔探頭實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)的MSI。

由于LSPR效應(yīng)，無孔針尖頂點(diǎn)的輻照度被放大，并作為直接電離的強(qiáng)化光源，使化學(xué)成像的橫向分辨率超越了遠(yuǎn)場(chǎng)衍射極限限制（圖5）。除了化學(xué)信息，在近場(chǎng)方法中使用的針尖可以同時(shí)獲得表面的拓?fù)湫畔ⅲ@對(duì)理解復(fù)雜的生物性質(zhì)是一種重要補(bǔ)充。

圖5 針尖增強(qiáng)質(zhì)譜的成像原理、模式和應(yīng)用

由于等離激元材料提供了增強(qiáng)的燒蝕作用，MSI系統(tǒng)和針尖增強(qiáng)方法的結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)微米/納米級(jí)空間分辨率的燒蝕并提供化學(xué)信息。研發(fā)人員開發(fā)一種離線質(zhì)譜方法來轉(zhuǎn)移和分析生物大分子，在分析血管緊張素II時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)直徑為1 μm的燒蝕坑。近場(chǎng)針尖增強(qiáng)的ICP-MS可以在葉子和花瓣上進(jìn)行單次測(cè)量，橫向分辨率為300 nm。此外，將掃描隧道顯微鏡（STM）與自制的反射光飛行時(shí)間質(zhì)譜儀結(jié)合起來，可以以50 nm的橫向分辨率對(duì)KI殘留物的圖案進(jìn)行成像（圖5）。

針尖增強(qiáng)的納米光譜成像：納米級(jí)的分辨率

掃描探針顯微鏡（SPM）可以獲取單分子的原子級(jí)分辨率圖像，然而獲得的化學(xué)信息有限。相比之下，光譜工具提供了獲得分子的振動(dòng)/電子信息的機(jī)會(huì)，因此可以進(jìn)行化學(xué)分析鑒定。但是光譜技術(shù)的成像空間分辨率是由半波長衍射極限（>200 nm）決定的。為了獲得超高空間成像分辨率以及化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，科學(xué)家們將SPM和光譜學(xué)結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)了針尖增強(qiáng)的納米光譜學(xué)技術(shù)。它在測(cè)量生物樣品或納米材料的形態(tài)、并同時(shí)獲得樣品化學(xué)分布和物理特性等方面具有很大的潛力。針尖增強(qiáng)納米光譜成像技術(shù)按發(fā)展的時(shí)間順序可細(xì)分為幾種技術(shù)：散射型掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡（s-SNOM）、針尖增強(qiáng)拉曼光譜（TERS）、針尖增強(qiáng)熒光光譜（TEFS）和同步針尖增強(qiáng)拉曼和熒光的雙模式（TERS-TEFS）。

s-SNOM借助原子力顯微鏡（AFM）的空間分辨率提供樣品表面的化學(xué)和光學(xué)特性信息（圖6）。s-SNOM的發(fā)明大大促進(jìn)了納米級(jí)生物成像技術(shù)的發(fā)展。例如通過配備寬帶紅外光源，利用金涂層針尖掃描單個(gè)包膜病毒可以追蹤病毒破裂過程中的細(xì)微結(jié)構(gòu)和指紋光譜變化。s-SNOM還可以掃描單個(gè)蛋白并實(shí)現(xiàn)30 nm橫向分辨率的圖像。獨(dú)特的吸收光譜表明，胰島素的二級(jí)β-折疊結(jié)構(gòu)被外部的α-螺旋結(jié)構(gòu)所包裹（圖6）。

圖6s-SNOM、TERS原理及生物成像應(yīng)用

TERS為探索生物組織的超分辨拉曼散射提供了機(jī)會(huì)。例如，TERS可以識(shí)別蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特定官能團(tuán)的比例，并獲得用于測(cè)序的無標(biāo)簽DNA或RNA信號(hào)（圖6）。TERS可以獲得納米區(qū)域內(nèi)的胰島素纖維的特征信號(hào)。高空間分辨率的光譜顯示，只有34%的纖維素表面是純?chǔ)?折疊，其余的由α-螺旋和無序結(jié)構(gòu)部分組成。TERS已被用于DNA研究，如測(cè)序和監(jiān)測(cè)DNA鏈的斷裂過程。在超高真空（10-10 torr）和低溫（80 K）的環(huán)境下，通過配備光學(xué)低損耗的銀尖端，TERS掃描可以將腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）堿基氫鍵網(wǎng)絡(luò)的分辨率進(jìn)一步提高到亞納米水平。

針尖增強(qiáng)熒光光譜（TEFS）幾乎與TERS同期發(fā)展。與拉曼光譜不同，熒光光譜可以提供有關(guān)材料的電子特性和光激發(fā)狀態(tài)的弛豫動(dòng)態(tài)的信息。TEFS的實(shí)現(xiàn)方式（圖7）與TERS相似，而增強(qiáng)效應(yīng)的規(guī)則并不相同。在熒光增強(qiáng)和淬滅之間存在著一種競(jìng)爭(zhēng)性的效應(yīng)。比如在垂直方向上，偶極子發(fā)射器金屬表面上的球形納米粒子模型系統(tǒng)中，熒光速率經(jīng)歷了從增強(qiáng)到淬滅的轉(zhuǎn)變。熒光增強(qiáng)在距離z～5 nm時(shí)達(dá)到最大值（圖7）。

圖7 基于等離激元材料，制造s-SNOM針尖以獲得更強(qiáng)的信號(hào)

先進(jìn)的近場(chǎng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)亞衍射極限的成像。比如利用孔徑上的尖端策略可獲得空間分辨率為26 nm ± 4 nm的細(xì)胞成像。光學(xué)納米天線可以清楚地分辨出其原生環(huán)境中的蛋白質(zhì)，增強(qiáng)熒光圖像的空間分辨率為50 nm。另外，無孔針尖可以觀察小分子和蛋白質(zhì)之間相互作用的更多細(xì)節(jié)。熒光標(biāo)記DNA的針尖增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM）和AFM成像聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)39nm的空間分辨率。理想條件下，利用銀尖端的單個(gè)原子和NaCl層隔離的銀基質(zhì)，可以以0.8 nm的空間分辨率對(duì)單個(gè)酞菁分子進(jìn)行成像。這些概念性研究的成功為推動(dòng)TEFS以超高空間分辨率獲得復(fù)雜生物體系成像奠定了基礎(chǔ)。

TERS用于獲得分子的化學(xué)鍵振動(dòng)信息，而TEFS可以獲得分子的電子轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)信息。這兩種技術(shù)的結(jié)合可以在同一臺(tái)儀器上實(shí)現(xiàn)，被稱為TERS-TEFS，以實(shí)現(xiàn)更全面的材料表征。針尖增強(qiáng)的近場(chǎng)光學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高對(duì)比度和高空間分辨率（17 nm）的有機(jī)半導(dǎo)體薄膜（diindenoperylene，DIP）的圖像，拉曼指紋出現(xiàn)在熒光背景的頂部，表明目標(biāo)分子是直立的。此外，TERS-TEFS技術(shù)可用于同時(shí)獲得單層卟啉分子的振動(dòng)信號(hào)和激發(fā)態(tài)能量衰減路徑。盡管被廣泛用于材料應(yīng)用，但TERS-TEFS中使用的貴金屬針尖在實(shí)際系統(tǒng)中很容易被污染，導(dǎo)致光譜干擾。

使用殼隔絕的針尖在屏蔽干擾的同時(shí)，可獲得增強(qiáng)且重復(fù)性好的拉曼和熒光信號(hào)，二者的相對(duì)強(qiáng)度可以通過包覆不同厚度的殼層來調(diào)節(jié)。在實(shí)踐中，熒光背景可能會(huì)影響拉曼信號(hào)，也就是說主要的拉曼帶位于寬闊的熒光峰區(qū)。為了解決干擾問題，作者介紹一個(gè)整合兩個(gè)激光設(shè)備的想法，在針尖共聚焦光譜系統(tǒng)中研究R6G分子，其中一個(gè)532 nm的連續(xù)波激光用于激發(fā)分子熒光，一個(gè)632.8 nm的He-Ne激光用于激發(fā)拉曼信號(hào)（圖7）。將針尖-樣品的距離優(yōu)化為2 nm，使得拉曼區(qū)遠(yuǎn)離熒光區(qū)，巧妙地避免了相互干擾。

等離激元/分子尺：納米/埃米尺度分辨率

等離激元尺由兩個(gè)納米粒子和它們之間的連接物組成。其原理是基于測(cè)量與粒子間的距離有關(guān)的等離激元共振吸收峰位置的移動(dòng)或顏色的變化（如圖8）。例如，在引入另一個(gè)生物分子時(shí)，由生物分子（如DNA鏈）連接的金納米粒子二聚體的距離發(fā)生了變化，導(dǎo)致等離激元譜共振波長的急劇變化。暗場(chǎng)散射光譜反映出“侵入”生物分子的特性。等離激元尺包含成對(duì)的納米粒子，可以準(zhǔn)確測(cè)量和分析單個(gè)生物分子的特性，包括距離變化和生理化學(xué)特性。

圖8等離激元尺的原理和生物成像應(yīng)用

等離激元尺可用于動(dòng)態(tài)觀察體外DNA分子的生物物理過程（圖8）。比如使用金納米粒子衛(wèi)星等離激元尺系統(tǒng)，通過核心粒子周圍的肽連接，可以觀察到活細(xì)胞中單個(gè)生物分子的長時(shí)間變化軌跡。此外，等離激元尺還可以研究蛋白質(zhì)的活性以及研究DNA在酶作用下的彎曲和斷裂過程。雖然一維等離激元尺可以研究亞納米尺度的生物分子的基本參數(shù)，但不利于全面了解軟物質(zhì)運(yùn)動(dòng)/反應(yīng)過程。而通過電子束光刻和逐層納米堆積技術(shù)構(gòu)建的"H型"結(jié)構(gòu)，具有尖銳的散射光譜。任何輕微變化（埃米尺度）都可以產(chǎn)生可觀察到的光學(xué)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)高分辨率的傳感。

作者進(jìn)一步設(shè)想，生化連接物可以連接這些三維等離激元尺進(jìn)行生物測(cè)量。例如，三維等離子體標(biāo)尺可以在不同的位置附著在大分子上，如DNA/RNA鏈或蛋白質(zhì)，然后在暗場(chǎng)顯微鏡下測(cè)量光散射光譜，以解析目標(biāo)分子的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。

圖9 分子尺的原理和應(yīng)用

金納米粒子上用雙鏈DNA構(gòu)建的等離激元尺，可以用它來測(cè)量由各種內(nèi)切酶定制的DNA的長度或堿基對(duì)的數(shù)量（圖9）。暗場(chǎng)散射譜以亞納米的軸向分辨率記錄了金納米連接物的等離激元共振波長與DNA長度之間的關(guān)系，顯示每個(gè)DNA堿基對(duì)的平均波長變化約為1.24 nm。若是將一系列具有R6G染料修飾的dsDNA分子尺連接到Au納米粒子上，可以觀察到距離相關(guān)的SERS現(xiàn)象，可用于探明與距離相關(guān)的生物過程（圖9）。另外一種帶有探測(cè)分子的分子尺，即紫羅堿基團(tuán)沿著骨架鏈在不同的分子位置上移動(dòng)（圖9），可以用來分析光學(xué)納米腔內(nèi)電磁場(chǎng)強(qiáng)度的不均勻性，空間分辨率為0.2 nm，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電磁場(chǎng)形成了一個(gè)梳狀，其強(qiáng)度不均勻，梯度大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出預(yù)期。

這些分子尺技術(shù)顯示了在超高空間分辨率下研究單個(gè)實(shí)體構(gòu)象變化的巨大潛力。作者設(shè)想將生物分子附著在分子尺的特定位置上并放置于等離激元場(chǎng)中，生物分子的微妙特征將被明確地展示出來。

總體而言，盡管目前有許多臨床測(cè)量和成像技術(shù)，但由于衍射限制，它們的空間分辨率被限制在亞微米水平。另外，靈敏度不足進(jìn)一步阻礙了它們?cè)诔蜐舛葌鞲蟹矫娴膽?yīng)用。等離激元技術(shù)正在為具有化學(xué)敏感性和空間分辨率的生物成像鋪平道路。等離激元學(xué)的基本物理效應(yīng)，如電磁場(chǎng)增強(qiáng)、等離激元散射和熱效應(yīng)，支撐起了許多先進(jìn)技術(shù)，包括SERS、TEAI-MS、針尖增強(qiáng)納米光譜（紅外、拉曼、熒光等）和等離激元子/分子尺。這些新興技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)微米、納米、甚至亞納米級(jí)別的空間分辨率，可以應(yīng)用于生命科學(xué)的體外和/或體內(nèi)成像。

然而，為了更深入廣泛的應(yīng)用于生物體系成像分析，等離激元技術(shù)需要進(jìn)一步發(fā)展：（1）實(shí)現(xiàn)埃級(jí)的超高分辨率，為解開復(fù)雜生物分子的微妙動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)提供幫助；（2）在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)已證實(shí)了等離激元技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)成像中的可行性，但是還需要技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，在臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證該技術(shù)的有效性；（3）突破單一化的技術(shù)模式，發(fā)展多模態(tài)聯(lián)用技術(shù)為生物研究和臨床診斷提供完整多層次的圖像信息。

審核編輯：劉清