過敏原特異性IgE（sIgE）是過敏原篩選和診斷中重要的過敏原標(biāo)志物之一。近年來，食物過敏已成為一個全球性的健康問題。近年來，等溫核酸擴(kuò)增，如雜交鏈反應(yīng)和滾動圈擴(kuò)增，對提高生化傳感器的靈敏度有顯著的作用。鑒于核酸探針和相關(guān)擴(kuò)增方法的多樣性，各種自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)方案已經(jīng)被設(shè)計出來，為實現(xiàn)敏感的生物分析帶來了巨大的希望。然而，線性DNA納米結(jié)構(gòu)帶來的信號放大效率是有限的。為了克服這一缺點，研究人員開發(fā)了分枝或樹突狀的非線性自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)。

因此，基于非線性自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)實現(xiàn)sIgE的高靈敏度檢測是可能的。微流控芯片可以將基本操作單元集成到厘米級芯片上，在以患者為中心的醫(yī)學(xué)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。為了實現(xiàn)便攜即時檢測，研究人員已經(jīng)提出了各種芯片上的實驗室免疫測定方法。然而，很少有免疫分析方法能夠?qū)崿F(xiàn)血液中敏感、準(zhǔn)確和多種分析物的綜合特征。

近期，華僑大劉斌、魏曉峰教授課題組報道了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)輔助DNA樹突狀分子探針的微流控免疫傳感平臺，用于靈敏檢測多種sIgEs。相關(guān)成果以“Microfluidic Immunosensing Platform Based onRolling Circle Amplification-Assisted DNA Dendrimer Probe for Portable andSensitive Detection of Allergen-Specific IgE”為題發(fā)表在國際化學(xué)權(quán)威雜志Analytical Chemistry上。

在臨床診斷中，捕獲的抗原/抗體主要通過化學(xué)修飾固定在基底上。然而，這些方法可能導(dǎo)致捕獲的抗原/抗體構(gòu)象發(fā)生改變，甚至可能導(dǎo)致其蛋白活性降低。His6-tag與金屬離子的高親和力合作相互作用幾乎是自發(fā)發(fā)生的，并且已被證明是一種強(qiáng)大的生物偶聯(lián)策略。His6-tag由對Ni2?具有特殊親和力的組氨酸殘基組成。組氨酸側(cè)鏈含有咪唑基團(tuán)，能與Ni2?配合，促進(jìn)His6-tag標(biāo)記蛋白與Ni-IMAC磁珠結(jié)合。His6-tag的引入不僅保持了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且為捕獲的抗原/抗體結(jié)合底物提供了額外的結(jié)合位點。在本研究中，這些過敏原N端或C端帶有His6-tag并在大腸桿菌中重組表達(dá)。

在此基礎(chǔ)上，研究人員提出了一種核酸擴(kuò)增熒光生物傳感器，利用核酸的堿基配對和特異性識別，組裝DNA樹突狀分子，用于便攜式循環(huán)檢測sIgE。Ni-IMAC磁珠附著His6-tag標(biāo)記的過敏原特異性識別和富集sIgE。DNA1與tDNA上的部分序列互補(bǔ)。通過與tDNA修飾的二抗免疫偶聯(lián)，在sIgE存在的情況下，DNA1和DNA2作為探針可以被識別并吸引到磁珠上。tDNA與DNA1和DNA2雜交形成DNA樹狀前體。隨后，由樹突前體和粘端環(huán)狀模板自組裝獲得樹突狀DNA。隨后，隨著RCA反應(yīng)的進(jìn)行形成最終的DNA樹突探針。最終熒光染料SYBR Green I嵌入DNA樹突探針最終產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號，實現(xiàn)sIgE的靈敏分析。

此外，組氨酸殘基具有咪唑基團(tuán)，能與Ni2?、Co2?等過渡金屬離子形成配位鍵。這些金屬離子可以通過螯合配體固定在色譜介質(zhì)上。當(dāng)向緩沖溶液中加入高濃度的咪唑時，咪唑會與His6-tag的蛋白競爭Ni2?的結(jié)合位點，具有鎳配位的His6-tag標(biāo)記蛋白將被洗脫。因此，基于DNA樹突的免疫傳感器具有良好的可逆性，可用于多次分析。

鈣鈦礦納米晶形狀控制合成示意圖

綜上所述，該研究將Ni-IMAC磁珠和DNA樹突探針集成到基于多通道微流控血液分析裝置的熒光免疫分析中，用于sIgE的定量分析。該策略包括以下進(jìn)展：

（1）多通道芯片能夠同時檢測多個目標(biāo)；

（2）熒光染料介導(dǎo)的DNA樹狀大分子擴(kuò)增熒光信號，實現(xiàn)高靈敏度，LOD在25-50 pg/mL；

（3）基于His6-tag的Ni-IMAC磁珠免疫試驗具有良好的可逆性；

（4）mcWBAD濾過血細(xì)胞直接檢測全血樣本。

此外，該策略中使用His6-tag和Ni-IMAC磁珠有效地減少了假陽性信號，這對于準(zhǔn)確的sIgE分析至關(guān)重要。由于能夠根據(jù)sIgE水平區(qū)分牡蠣致敏患者和健康志愿者，顯示出該方法在食物過敏診斷方面具有重要的潛力。

論文鏈接： https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c00255