以高通量方式對(duì)多種分析物進(jìn)行無(wú)標(biāo)記檢測(cè)是生物傳感應(yīng)用領(lǐng)域長(zhǎng)期追求的目標(biāo)之一。然而，對(duì)于全光學(xué)方法而言，如何將最先進(jìn)的無(wú)標(biāo)記技術(shù)與能高通量處理小體積樣品的微流控技術(shù)以及能賦予分析特異性的表面化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，是迄今為止面臨的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。

據(jù)麥姆斯咨詢(xún)報(bào)道，近期，來(lái)自瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院（ETH Zurich）和美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬麻省總醫(yī)院（Massachusetts General Hospital，Harvard Medical School）的研究人員提出了一種無(wú)標(biāo)記光流控（optofluidic）平臺(tái)，它將最先進(jìn)的數(shù)字全息技術(shù)與基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控技術(shù)相結(jié)合，并利用支撐性脂質(zhì)雙層膜（SLB）作為表面化學(xué)構(gòu)件，將這兩種技術(shù)融為一體。具體而言，這種光流控平臺(tái)通過(guò)具有單顆粒靈敏度的多路復(fù)用無(wú)標(biāo)記免疫親和檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)異質(zhì)生物納米顆粒群的指紋識(shí)別。相關(guān)研究成果以“Molecular fingerprinting of biological nanoparticles with a label-free optofluidic platform”為題發(fā)表在Nature Communications期刊上。

在這項(xiàng)工作中，研究人員圍繞以下三個(gè)方面，實(shí)現(xiàn)了對(duì)異質(zhì)納米顆粒懸浮液進(jìn)行無(wú)標(biāo)記分子指紋分析的目標(biāo)：（1）單顆粒靈敏度的大視場(chǎng)（FOV）成像；（2）高通量、小體積和可單獨(dú)尋址的微流控通道；（3）用于拉下免疫親和檢測(cè)的片內(nèi)表面功能化方法。

圖1 無(wú)標(biāo)記光流控平臺(tái)的示意圖和工作流程

首先，為了實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)（FOV）成像，研究人員使用了反射式內(nèi)聯(lián)全息顯微鏡，由于該研究只對(duì)微流控芯片表面和固定在其上的納米顆粒之間的干涉感興趣，因此需要借助空間非相干光源來(lái)實(shí)現(xiàn)。圖1B展示了光流控平臺(tái)的光學(xué)讀出策略。作為成像區(qū)域，該研究的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)100 μm × 100 μm左右的照明FOV，由于微流控芯片中多個(gè)密接界面反射產(chǎn)生的有害寄生條紋的存在，使用高數(shù)值孔徑（NA）物鏡的干涉散射（iSCAT）顯微鏡（一種數(shù)字內(nèi)聯(lián)全息方法）很難實(shí)現(xiàn)這種效果。通過(guò)微流控芯片成像時(shí)，利用空間非相干照明除了能夠減少這些寄生干擾，還能大大降低斑點(diǎn)的影響。因此，該研究利用窄帶光纖耦合發(fā)光二極管（LED）作為光源成像到樣品上。樣品的散射光以及微流控芯片基底界面的微弱反射光被NA物鏡收集，隨后，二者之間的干涉被成像到相機(jī)上。為了擴(kuò)展FOV，研究人員按照既定的計(jì)算機(jī)視覺(jué)程序拼接了一系列光柵掃描圖像。

為了滿足小體積試劑、多路復(fù)用和通量的需求，研究人員使用了基于Quake微閥的PDMS基微流控芯片（圖1C）。這種微流控芯片由控制層（橙色）和流動(dòng)層（淺藍(lán)色）組成，可獨(dú)立處理不同的傳感通道（黑色箭頭），在不受使用者操作干擾的情況下可以精細(xì)控制免疫捕獲檢測(cè)的每一步。此外，在該研究提出的微流控芯片的每個(gè)微流控通道中可以獨(dú)立進(jìn)行不同的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)計(jì)算機(jī)界面對(duì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行程序化控制，從而為實(shí)現(xiàn)免疫檢測(cè)的長(zhǎng)期自動(dòng)化提供了可能。此外，就該微流控免疫檢測(cè)平臺(tái)使用的樣品總體積而言，每個(gè)傳感區(qū)域的體積大約為10 nL（長(zhǎng)、寬、高分別為3 mm、0.3 mm和0.01 mm），加上通道的入口和出口路徑區(qū)域，每個(gè)微流控通道的體積大約為40 nL。因此，整個(gè)微流控芯片使用的樣品量總計(jì)不到0.5 μL。

最后，在表面化學(xué)方面，為了將建立的微流控技術(shù)和成像技術(shù)結(jié)合在一起，研究人員選擇了SLB（圖1D）作為片內(nèi)功能化方案的基材，這是因?yàn)镾LB具有仿生性質(zhì)，易于制備，且具有內(nèi)在防污特性和片上兼容性。通過(guò)熔融輔助囊泡融合方法制備的SLB可以同時(shí)作為防止非特異性結(jié)合的鈍化涂層，以及免疫捕獲拉下檢測(cè)的構(gòu)件。

隨后，研究人員對(duì)構(gòu)建的光流控免疫檢測(cè)平臺(tái)的穩(wěn)健性和檢測(cè)性能進(jìn)行了表征，并將其應(yīng)用于通過(guò)表面蛋白生物標(biāo)志物對(duì)四種不同的卵巢細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（EV）群進(jìn)行分析，從而為每種細(xì)胞系開(kāi)發(fā)出獨(dú)特的生物標(biāo)志物指紋。

圖2 光流控免疫檢測(cè)平臺(tái)的重現(xiàn)性和穩(wěn)健性

圖3 多路復(fù)用細(xì)胞外囊泡（EV）指紋圖譜

綜上所述，這項(xiàng)研究提出了一種利用微流控芯片上空間相互隔離的微通道對(duì)溶液中的生物納米顆粒進(jìn)行多路復(fù)用和分析的方法。該研究提出的微流控芯片可以通過(guò)增加獨(dú)立通道的數(shù)量對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)展以實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的器件設(shè)計(jì)。因此，微流控器件的大小和復(fù)雜程度將成為多路復(fù)用的最終限制因素。不過(guò)，作為一種補(bǔ)充途徑，該研究提出的平臺(tái)也完全兼容單分子熒光讀出方法，因此可以與最先進(jìn)的熒光標(biāo)記抗體或aptamer文庫(kù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模單顆粒分析。展望未來(lái)，將該研究提出的光流控平臺(tái)與片上標(biāo)準(zhǔn)加入法和改進(jìn)的表面鈍化技術(shù)相結(jié)合，就能根據(jù)選定的疾病生物標(biāo)志物對(duì)疾病進(jìn)行診斷和護(hù)理監(jiān)測(cè)。

總之，研究結(jié)果表明，該研究提出的光流控平臺(tái)整合了必要的檢測(cè)步驟，能以無(wú)標(biāo)記的方式對(duì)異質(zhì)生物納米顆粒（例如EV）群體進(jìn)行分子級(jí)別的分析，并具有單顆粒靈敏度、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的穩(wěn)健性和高度的可重復(fù)性。該平臺(tái)的光學(xué)讀出技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫檢測(cè)流程的持續(xù)原位監(jiān)測(cè)，從而能夠從穩(wěn)健性、樣品制備時(shí)間和所得涂層的高質(zhì)量等方面優(yōu)化表面功能化方案。此外，該方法具有通過(guò)結(jié)合生物標(biāo)志物群的信息及其對(duì)比信息來(lái)研究EV潛在異質(zhì)性的能力?？梢灶A(yù)見(jiàn)，在不受顆粒對(duì)比度的大小和折射率影響后，這些檢測(cè)方法將為在單個(gè)EV層面結(jié)合分子指紋、大小和有效物質(zhì)組成信息，從而更好地表征和研究EV的異質(zhì)性鋪平道路。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41467-024-48132-4

審核編輯：劉清