糖作為生命體系中三大聚合物分子之一，具有遠(yuǎn)超核酸和蛋白的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。實現(xiàn)高效的糖結(jié)構(gòu)鑒定和序列解析是開展糖類物質(zhì)活性與功能研究的基礎(chǔ)，是推動糖科學(xué)快速發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。前期工作中，中國科學(xué)院上海藥物研究所研究員高召兵聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊利用基因工程改造后的生物納米孔描繪了糖官能團(tuán)的電信號指紋圖譜，將納米孔在糖領(lǐng)域的研究從“糖檢測”推進(jìn)至“糖測序”階段，納米孔糖測序已成為研究熱點。糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具備對復(fù)雜聚糖的綜合傳感能力是實現(xiàn)納米孔糖測序需要解決的前提之一，然而已有納米孔均不具備區(qū)分復(fù)雜聚糖的能力。

近日，高召兵與上海藥物所副研究員夏冰清，研究員文留青、程曦等，在前期工作基礎(chǔ)上設(shè)計并構(gòu)建了新型工程化生物納米孔。利用該納米孔，團(tuán)隊取得了糖測序研發(fā)進(jìn)程中的多項進(jìn)展，實現(xiàn)了鏈長達(dá)到十糖的復(fù)雜聚糖電信號解析，并達(dá)到了單糖分辨率，同時實現(xiàn)復(fù)雜聚糖分子異構(gòu)體的區(qū)分。該工作是生物納米孔糖測序技術(shù)研發(fā)進(jìn)程中的節(jié)點性工作。相關(guān)成果以“Direct Identification of Complex Glycans via a Highly Sensitive Engineered Nanopore”為題發(fā)表在《美國化學(xué)會志》上，并被選為封面文章。研究工作得到國家杰出青年科學(xué)基金、上海市自然科學(xué)基金等的支持。

為進(jìn)一步優(yōu)化突變納米孔α -溶血素（M113R）的檢測靈敏度以及檢測窗口，該團(tuán)隊基于前期的工作對M113R進(jìn)行新一輪基因工程改造。在保留一級傳感位點M113R的基礎(chǔ)上，對多個二級位點進(jìn)行了丙氨酸突變，這有利于在維持信號響應(yīng)的同時增大對糖分子鏈長或體積的檢測限。研究篩選獲得了在大尺寸復(fù)雜聚糖傳感中表現(xiàn)出較大潛力的工程化納米孔α -溶血素（M113R/T115A）。利用該突變納米孔，研究人員獲得了只存在單糖差異的聚糖電信號，表征了聚糖中的單糖結(jié)構(gòu)差異，說明M113R/T115A納米孔對糖分子結(jié)構(gòu)具備單糖分辨率。研究團(tuán)隊利用M113R/T115A實現(xiàn)了從五糖到十糖的連續(xù)檢測，對其實現(xiàn)了顯著區(qū)分，納米孔對于寡糖的實際讀長達(dá)到10，為實現(xiàn)糖測序打下了基礎(chǔ)。研究利用該納米孔檢測了具有不同糖苷鍵的寡糖異構(gòu)體，實現(xiàn)了不同鏈長異構(gòu)體的區(qū)分，區(qū)分度達(dá)0.9，說明該納米孔可同時區(qū)分多種寡糖的結(jié)構(gòu)差異。進(jìn)一步通過剖析納米孔-糖互作模式，研究人員闡明了納米孔高靈敏度鑒定復(fù)雜聚糖微小差異的分子機(jī)制。該團(tuán)隊提供了實現(xiàn)復(fù)雜聚糖鏈長和結(jié)構(gòu)區(qū)分的納米孔設(shè)計范式，其單糖分辨率、鏈長讀取能力、異構(gòu)差異區(qū)分等為最終攻克納米孔糖測序發(fā)展過程中多個無法規(guī)避的難點提供了借鑒。



納米孔M113R/T115A區(qū)分復(fù)雜聚糖原理示意圖

綜上所述，聚糖的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性包括種類豐富的單糖構(gòu)建模塊、多種形式的糖苷鍵、長短不一的鏈長和分支等，這給聚糖分析帶來了挑戰(zhàn)。該研究設(shè)計的工程化納米孔提供了無適配體、高分辨率的方法，實現(xiàn)了對聚糖結(jié)構(gòu)的多方位區(qū)分，并在大尺寸、多官能團(tuán)、極微差異的復(fù)雜聚糖區(qū)分方面取得進(jìn)展。

論文鏈接： https://doi.org/10.1021/jacs.4c02081

審核編輯：劉清