糖作為生命體系中三大聚合物分子之一，具有遠(yuǎn)超核酸和蛋白的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。實(shí)現(xiàn)高效的糖結(jié)構(gòu)鑒定和序列解析是開(kāi)展糖類(lèi)物質(zhì)活性與功能研究的基礎(chǔ)，是推動(dòng)糖科學(xué)快速發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。前期工作中，中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所研究員高召兵聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)利用基因工程改造后的生物納米孔描繪了糖官能團(tuán)的電信號(hào)指紋圖譜，將納米孔在糖領(lǐng)域的研究從“糖檢測(cè)”推進(jìn)至“糖測(cè)序”階段，納米孔糖測(cè)序已成為研究熱點(diǎn)。糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具備對(duì)復(fù)雜聚糖的綜合傳感能力是實(shí)現(xiàn)納米孔糖測(cè)序需要解決的前提之一，然而已有納米孔均不具備區(qū)分復(fù)雜聚糖的能力。

近日，高召兵與上海藥物所副研究員夏冰清，研究員文留青、程曦等，在前期工作基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并構(gòu)建了新型工程化生物納米孔。利用該納米孔，團(tuán)隊(duì)取得了糖測(cè)序研發(fā)進(jìn)程中的多項(xiàng)進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)了鏈長(zhǎng)達(dá)到十糖的復(fù)雜聚糖電信號(hào)解析，并達(dá)到了單糖分辨率，同時(shí)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜聚糖分子異構(gòu)體的區(qū)分。該工作是生物納米孔糖測(cè)序技術(shù)研發(fā)進(jìn)程中的節(jié)點(diǎn)性工作。相關(guān)成果以“Direct Identification of Complex Glycans via a Highly Sensitive Engineered Nanopore”為題發(fā)表在《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》上，并被選為封面文章。研究工作得到國(guó)家杰出青年科學(xué)基金、上海市自然科學(xué)基金等的支持。

為進(jìn)一步優(yōu)化突變納米孔α -溶血素（M113R）的檢測(cè)靈敏度以及檢測(cè)窗口，該團(tuán)隊(duì)基于前期的工作對(duì)M113R進(jìn)行新一輪基因工程改造。在保留一級(jí)傳感位點(diǎn)M113R的基礎(chǔ)上，對(duì)多個(gè)二級(jí)位點(diǎn)進(jìn)行了丙氨酸突變，這有利于在維持信號(hào)響應(yīng)的同時(shí)增大對(duì)糖分子鏈長(zhǎng)或體積的檢測(cè)限。研究篩選獲得了在大尺寸復(fù)雜聚糖傳感中表現(xiàn)出較大潛力的工程化納米孔α -溶血素（M113R/T115A）。利用該突變納米孔，研究人員獲得了只存在單糖差異的聚糖電信號(hào)，表征了聚糖中的單糖結(jié)構(gòu)差異，說(shuō)明M113R/T115A納米孔對(duì)糖分子結(jié)構(gòu)具備單糖分辨率。研究團(tuán)隊(duì)利用M113R/T115A實(shí)現(xiàn)了從五糖到十糖的連續(xù)檢測(cè)，對(duì)其實(shí)現(xiàn)了顯著區(qū)分，納米孔對(duì)于寡糖的實(shí)際讀長(zhǎng)達(dá)到10，為實(shí)現(xiàn)糖測(cè)序打下了基礎(chǔ)。研究利用該納米孔檢測(cè)了具有不同糖苷鍵的寡糖異構(gòu)體，實(shí)現(xiàn)了不同鏈長(zhǎng)異構(gòu)體的區(qū)分，區(qū)分度達(dá)0.9，說(shuō)明該納米孔可同時(shí)區(qū)分多種寡糖的結(jié)構(gòu)差異。進(jìn)一步通過(guò)剖析納米孔-糖互作模式，研究人員闡明了納米孔高靈敏度鑒定復(fù)雜聚糖微小差異的分子機(jī)制。該團(tuán)隊(duì)提供了實(shí)現(xiàn)復(fù)雜聚糖鏈長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)區(qū)分的納米孔設(shè)計(jì)范式，其單糖分辨率、鏈長(zhǎng)讀取能力、異構(gòu)差異區(qū)分等為最終攻克納米孔糖測(cè)序發(fā)展過(guò)程中多個(gè)無(wú)法規(guī)避的難點(diǎn)提供了借鑒。



納米孔M113R/T115A區(qū)分復(fù)雜聚糖原理示意圖

綜上所述，聚糖的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性包括種類(lèi)豐富的單糖構(gòu)建模塊、多種形式的糖苷鍵、長(zhǎng)短不一的鏈長(zhǎng)和分支等，這給聚糖分析帶來(lái)了挑戰(zhàn)。該研究設(shè)計(jì)的工程化納米孔提供了無(wú)適配體、高分辨率的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)聚糖結(jié)構(gòu)的多方位區(qū)分，并在大尺寸、多官能團(tuán)、極微差異的復(fù)雜聚糖區(qū)分方面取得進(jìn)展。

論文鏈接： https://doi.org/10.1021/jacs.4c02081

審核編輯：劉清