圖 1：使用分光器的多焦點(diǎn)平面顯微鏡。樣本中的兩個(gè)不同焦平面(一紅一藍(lán))由50:50分光器分割。反射光(藍(lán)色)被發(fā)送到相機(jī)1，而透射光(紅色)被發(fā)送到相機(jī)2。通過(guò)這種方式，可以同時(shí)對(duì)兩個(gè)不同的焦平面進(jìn)行成像。或者，可以使用發(fā)射圖像分離器通過(guò)一個(gè)檢測(cè)器對(duì)兩個(gè)焦平面進(jìn)行成像。

介紹

分光器是一種將光(例如激光束)分成兩束(或多束)的光學(xué)裝置。分光器在顯微鏡中非常有用，因?yàn)樗鼈兛梢猿洚?dāng)顯微鏡和探測(cè)器/相機(jī)之間的接口，分離顯微鏡的發(fā)射光。

分光器有兩種主要類(lèi)型：發(fā)射圖像分光器將光分到單個(gè)相機(jī)傳感器上，以便一臺(tái)相機(jī)可以同時(shí)對(duì)多個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行成像;多相機(jī)適配器將光分到多個(gè)相機(jī)上，從而允許一個(gè)樣品同時(shí)成像多個(gè)相機(jī)。這兩種分光器裝置本質(zhì)上都允許在多個(gè)波長(zhǎng)、偏振狀態(tài)或振幅下同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行成像。有關(guān)分離器的介紹，請(qǐng)參閱我們的技術(shù)說(shuō)明：“分離器簡(jiǎn)介”。

本文將介紹如何使用此類(lèi)分光器設(shè)備來(lái)增強(qiáng)顯微鏡技術(shù)和高級(jí)成像應(yīng)用。為什么要使用分離器?

需要分離器的技術(shù)

分光器允許同時(shí)對(duì)不同狀態(tài)進(jìn)行成像：無(wú)需手動(dòng)或使用電子開(kāi)關(guān)調(diào)整顯微鏡設(shè)置，而是可以無(wú)延遲地光學(xué)獲取兩種狀態(tài)。多焦平面顯微鏡 (MPM)是這對(duì)于成像應(yīng)用有用的一個(gè)示例，如圖 1所示。 MPM 涉及同時(shí)對(duì)同一樣本的兩個(gè)不同焦平面進(jìn)行成像，而不是手動(dòng)調(diào)整焦點(diǎn)，然后在不同的所需焦平面處拍攝圖像。

如果對(duì) 2D 細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行成像，一個(gè)焦平面通常就足夠了，因?yàn)榇蠖鄶?shù)細(xì)胞制劑都不是很厚。但隨著越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始對(duì)更大的 3D 樣本進(jìn)行成像，MPM 提供了一種有用的方法，可以在細(xì)胞在 3D 支架中相互作用或較大的生物體進(jìn)行動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)時(shí)對(duì)多個(gè)所需焦平面進(jìn)行成像。對(duì)實(shí)時(shí) 3D 樣品進(jìn)行成像時(shí)，高速是必要的，并且由于無(wú)需手動(dòng)調(diào)整焦點(diǎn)，MPM 提供了一種高速選項(xiàng)，可同時(shí)對(duì)穿過(guò)樣品的多個(gè) z 平面進(jìn)行成像。 MPM 的實(shí)際應(yīng)用示例如圖 2所示。

圖 2：高速 MPM 可視化活體游泳的布氏錐蟲(chóng)寄生蟲(chóng)。該實(shí)驗(yàn)使用了四路發(fā)射圖像分離器 MultiSplit V2。A) 同一樣本的四個(gè)獨(dú)立圖像通道，每個(gè)圖像通道在不同的焦平面處拍攝。 B) 對(duì)四個(gè)獨(dú)立的焦平面進(jìn)行著色、組合和過(guò)濾。每種顏色都來(lái)自不同的焦平面。 C) 四個(gè)焦平面相互關(guān)系的直接可視化。圖片改編自惠勒 (2019)。

如果沒(méi)有分光器，等待樣品移動(dòng)到正確位置時(shí)可能會(huì)浪費(fèi)時(shí)間，例如選擇性平面照明顯微鏡 (SPIM) 等光片技術(shù)中的掃描。掃描還會(huì)因相機(jī)快門(mén)而產(chǎn)生拖尾效應(yīng)，并限制可用的曝光時(shí)間。通過(guò)同時(shí)捕捉多個(gè)興趣點(diǎn)，可以避免這些限制，從而可以捕捉 3D 空間中微小、微弱和快速移動(dòng)的物體。如果沒(méi)有分光器，MPM 就不可能實(shí)現(xiàn)，并且展示了操縱樣品發(fā)射光的強(qiáng)大功能和靈活性。

另一種需要分光器的技術(shù)是同時(shí) 多探針熒光成像，涉及不同熒光探針的同時(shí)成像。絕大多數(shù)熒光顯微鏡使用多個(gè)熒光團(tuán)，特別是在藍(lán)色通道通常被 DAPI(一種易于使用的細(xì)胞核標(biāo)記物)占據(jù)的細(xì)胞上，為標(biāo)記特定蛋白質(zhì)的其他熒光團(tuán)留下紅色和綠色通道。

顯微鏡通常有一個(gè)電子開(kāi)關(guān)，以便這些不同的熒光團(tuán)可以在不同的通道中成像，從而產(chǎn)生多通道圖像。切換時(shí)仍然存在時(shí)間延遲，并且使用分光器可以選擇同時(shí)對(duì)多個(gè)熒光波長(zhǎng)進(jìn)行成像，從而消除任何延遲。這在對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光成像時(shí)特別有用，可以高速捕獲快速動(dòng)態(tài)事件。除了結(jié)合熒光探針外，微分干涉對(duì)比 (DIC) 等明場(chǎng)圖像也可以與熒光圖像結(jié)合。

圖 3：多探針熒光成像。頂部圖像顯示兩個(gè)獨(dú)立的熒光通道(綠色和紅色)，以及可以通過(guò)使用分光器同時(shí)成像來(lái)實(shí)現(xiàn)的組合圖像。該圖像可以通過(guò)后處理生成，但時(shí)間和信息可能會(huì)丟失。底部圖像分別顯示明場(chǎng)圖像 (DIC) 和兩個(gè)熒光標(biāo)記物(黃色熒光蛋白 YFP 和 DAPI)，以及三者的組合。

分離器增強(qiáng)的技術(shù)

有些技術(shù)本質(zhì)上并不需要分離器來(lái)發(fā)揮作用，但它的包含使人受益匪淺。這主要是由于能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)不同狀態(tài)進(jìn)行成像，從而節(jié)省時(shí)間，并且根據(jù)技術(shù)的不同，其他優(yōu)點(diǎn)也有所不同。值得注意的是，幾乎所有先進(jìn)的顯微鏡應(yīng)用都受益于分光器和更靈活的成像能力，因此這里提到的技術(shù)只是冰山一角，本文絕不是詳盡無(wú)遺的。

其中一項(xiàng)技術(shù)是福斯特共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)，這是一種用于確定兩個(gè)熒光團(tuán)彼此是否在一定距離內(nèi)的技術(shù)。 FRET 利用熒光團(tuán)分子之間的能量轉(zhuǎn)移原理：類(lèi)似于兩個(gè)磁鐵只有在足夠靠近時(shí)才會(huì)吸引，兩個(gè)熒光團(tuán)只有在彼此距離在1-10 nm 以內(nèi)時(shí)才會(huì)交換能量。 FRET 中有兩種熒光分子：供體和受體，如果供體被激發(fā)并移動(dòng)到足夠靠近受體，它將轉(zhuǎn)移能量。隨后供體熒光的減少和受體熒光的增加可以通過(guò)顯微鏡輕松檢測(cè)到。這本質(zhì)上使 FRET 成為一種可以測(cè)量分子之間距離的“光譜尺”，因?yàn)橹挥挟?dāng)熒光團(tuán)彼此之間的距離在 10 nm 以內(nèi)時(shí)才會(huì)發(fā)生反應(yīng)。

由于有兩個(gè)熒光團(tuán)，用于激發(fā)它們的光應(yīng)該具有不同的波長(zhǎng)，否則，兩個(gè)熒光團(tuán)將同時(shí)被激活并且不會(huì)發(fā)生FRET。這意味著需要兩個(gè)特定波長(zhǎng)來(lái)處理兩種熒光團(tuán)，并且能夠?qū)煞N不同波長(zhǎng)進(jìn)行成像將使該技術(shù)更快、更有效，因?yàn)楫?dāng)熒光強(qiáng)度中一個(gè)波長(zhǎng)減少而另一個(gè)波長(zhǎng)增加時(shí)，會(huì)立即清楚。 FRET 是一種利用分離器的出色技術(shù)，如圖 4所示。

雖然圖 4中的所有三種方法在某些時(shí)候都使用分光器，但通過(guò)使用多相機(jī)適配器(圖 4C)，可以同時(shí)對(duì)兩種熒光團(tuán)進(jìn)行成像，使該版本成為最快且很適合活細(xì)胞成像的版本。由于沒(méi)有移動(dòng)部件，也沒(méi)有偽影，使用分離器設(shè)備的同步 FRET 增強(qiáng)了技術(shù)并允許更好的實(shí)驗(yàn)，從而改善動(dòng)態(tài)過(guò)程的成像。

圖 4：不同的 FRET 變化。 A) 可以交換兩個(gè)不同的分光器立方體(每個(gè)波長(zhǎng)一個(gè))以對(duì)兩個(gè) FRET 波長(zhǎng)進(jìn)行成像。該技術(shù)速度較慢，并且可能會(huì)引入偽影。 B) FRET 立方體，其中立方體與濾光輪配對(duì)，濾光輪選擇要分離的發(fā)射。這比交換立方體更快，并且更適合活細(xì)胞 FRET。C)使用多相機(jī)適配器的同步 FRET，其中可以通過(guò)將供體和受體分成兩個(gè)相機(jī)來(lái)同時(shí)測(cè)量它們的發(fā)射。此方法沒(méi)有移動(dòng)部件并且同時(shí)發(fā)生，使其成為最快且無(wú)偽影的方法。

另一種受益于分光器的技術(shù)是全內(nèi)反射熒光 (TIRF)，該技術(shù)涉及從表面反射光以僅對(duì)樣品的一小部分進(jìn)行成像。在 TIRF 中，激發(fā)激光的角度使其完全從玻璃樣品載玻片上反射。結(jié)果是所有激發(fā)光都被樣品反射走。然而，在光被反射的區(qū)域，一小部分光會(huì)擴(kuò)散到樣品的一小部分中。這種光的延伸被稱(chēng)為倏逝波，它通常只能穿透樣品約 100 nm，具體取決于顯微鏡光學(xué)器件。倏逝波與反射光的波長(zhǎng)相同，因此它仍然會(huì)激發(fā)這個(gè)小區(qū)域內(nèi)的任何熒光分子。

由于樣品的一小部分被照亮，與標(biāo)準(zhǔn)寬場(chǎng)熒光相比，離焦光少得多，信噪比也更好。由于 TIRF 僅限于單個(gè)焦平面(僅照亮約 100 nm 的樣品)，因此它對(duì)于研究靠近表面的樣品區(qū)域(例如固定在蓋玻片或細(xì)胞膜表面上的分子)特別有用。

由于曝光時(shí)間短和單焦平面，TIRF 通常用于動(dòng)態(tài)過(guò)程成像。為了使該技術(shù)更快并能夠?qū)Χ鄠€(gè)熒光團(tuán)進(jìn)行成像，分光器的使用取得了巨大成功，使 TIRF 更加強(qiáng)大。使用分離器，可以同時(shí)執(zhí)行多通道 TIRF(如圖 5C所示)，從而針對(duì)非?？焖俚氖录?yōu)化該技術(shù)。

圖 5： TIRF。 A) 單細(xì)胞的 TIRF，蓋玻片反射光產(chǎn)生的漸逝場(chǎng)會(huì)激發(fā)最靠近蓋玻片的精選少數(shù)熒光分子(綠色)。 B) TIRF 光路。 C) 同時(shí)多通道 TIRF，別顯示綠色和紅色通道以及組合的同步圖像。

概括

分光器的使用既可以催生新技術(shù)，又可以增強(qiáng)現(xiàn)有技術(shù)，使分光器設(shè)備成為顯微鏡和相機(jī)之間強(qiáng)大的接口，提高研究人員控制光和設(shè)計(jì)更靈活和優(yōu)雅實(shí)驗(yàn)的能力。

審核編輯 黃宇