文章來源：老千和他的朋友們

原文作者：孫千

本文主要講述拉曼光譜基礎(chǔ)知識。

想象一下，如果我們能夠"聽見"分子的"聲音"，那會是什么樣的？拉曼光譜技術(shù)正是這樣一種神奇的工具，它能夠探測分子內(nèi)部原子的振動模式，就像聽音樂一樣識別不同的分子"指紋"。

在過去十多年中，拉曼光譜已經(jīng)從物理和化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的專業(yè)工具發(fā)展成為分析科學(xué)中最重要的技術(shù)之一。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢在于對分子具有高度的敏感性，操作相對簡單，而且與紅外光譜不同，水的存在不會干擾檢測過程，更重要的是可以在不破壞樣品的情況下提供詳細(xì)的分子結(jié)構(gòu)信息。

基于這些獨(dú)特優(yōu)勢，拉曼光譜的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展。在材料科學(xué)中，它能夠識別石墨烯的層數(shù)和質(zhì)量，監(jiān)測半導(dǎo)體制造中的應(yīng)力狀態(tài)；在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，它可以識別疾病的分子特征、檢測個別細(xì)菌；在太空探索中，它甚至被用于火星探測任務(wù)尋找生命跡象。

拉曼散射的基本原理

要理解拉曼光譜，我們先從一個簡單的比喻開始。當(dāng)光照射到分子上時，就像用手敲擊一個音叉。大部分光會按原來的頻率反射回來，這種現(xiàn)象被稱為瑞利散射。然而，有一小部分光會帶著分子振動的信息返回，頻率發(fā)生了微小的變化，這就是拉曼散射現(xiàn)象。

這個現(xiàn)象的物理機(jī)制在于光與分子的相互作用。當(dāng)激光照射分子時，電磁場使分子產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極矩(為什么有電磁場？見備注——?dú)v史上的發(fā)現(xiàn))，可以用公式μ=αE來描述，其中α是分子極化率。關(guān)鍵在于分子的極化率會隨著原子振動而發(fā)生變化，我們可以將其展開為：

當(dāng)頻率為ω0的激光與頻率為ωq的分子振動相互作用時，產(chǎn)生三種不同的散射：瑞利散射(ω0)保持原始頻率；斯托克斯散射(ω0?ωq)頻率降低，相當(dāng)于分子從光中獲得振動能量；反斯托克斯散射(ω0+ωq )頻率升高，相當(dāng)于振動分子將能量傳給光子。

并不是所有分子振動都能產(chǎn)生拉曼信號，必須滿足選擇定則：(?α/?q)q0≠0，即分子極化率必須隨該振動發(fā)生變化。

圖1 |分子振動時發(fā)生兩種關(guān)鍵變化：極化率變化（分子"軟硬度"變化，紅線）產(chǎn)生拉曼信號，偶極矩變化（電荷分布"偏心程度"變化，藍(lán)線）產(chǎn)生紅外信號。雙原子分子只能拉伸振動，三原子分子可拉伸、彎曲等多種方式?？茖W(xué)家通過觀察紅線和藍(lán)線的"起伏變化"，就能預(yù)測哪種振動在拉曼或紅外光譜中出現(xiàn)，形成分子獨(dú)特的"光譜身份證"。

以具體例子來說明：氧分子中兩個原子相互靠近或遠(yuǎn)離時，電子云分布變化導(dǎo)致極化率改變，因此其伸縮振動是拉曼活性的。對于二氧化碳分子，對稱伸縮振動（兩鍵同時伸縮）主要改變極化率，是拉曼活性的；而反對稱伸縮振動主要改變偶極矩，是紅外活性的。

這揭示了重要的互補(bǔ)性：對稱振動通常拉曼活性強(qiáng)而紅外活性弱，反對稱振動則相反。因此拉曼光譜和紅外光譜是互補(bǔ)技術(shù)，結(jié)合使用可以獲得分子振動的完整信息。

歷史上的發(fā)現(xiàn)

19世紀(jì)60年代，英國物理學(xué)家麥克斯韋通過數(shù)學(xué)推導(dǎo)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)電場和磁場以特定方式相互轉(zhuǎn)化時，它們會以波的形式在空間中傳播，傳播速度恰好等于光速，這意味著光本身就是電磁波。換句話說，當(dāng)我們看到一束激光時，實(shí)際上是在觀察空間中相互垂直的電場E?和磁場B?在振蕩，它們都垂直于傳播方向并以光速向前傳播。

因此，當(dāng)激光照射分子時，實(shí)際上是電磁場的電場分量直接作用在分子上，引起電子云的微小位移，產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極矩μ=αE。所以激光本身就是電磁場，這就像問"為什么水波有水"一樣——因?yàn)榧す饩褪请姶艌龅膫鞑バ问剑@正是拉曼散射現(xiàn)象得以發(fā)生的物理基礎(chǔ)。

拉曼信號強(qiáng)度的物理本質(zhì)

拉曼散射的強(qiáng)度遵循一個重要的物理公式：

這個公式揭示了拉曼散射的深層物理機(jī)制。其中極化率變化項(xiàng)(?q/?α)2q0表明只有當(dāng)分子在振動過程中極化率發(fā)生變化時，才會產(chǎn)生拉曼散射，這正是拉曼活性的根本判據(jù)。

頻率依賴項(xiàng)(ω0?ωq)4展現(xiàn)了一個重要特性：使用更高頻率的激光可以顯著增強(qiáng)拉曼信號，因?yàn)樾盘枏?qiáng)度與頻率的四次方成正比。激光強(qiáng)度項(xiàng)E20則直接表明拉曼強(qiáng)度與入射激光功率成正比關(guān)系。

備注：α是分子的極化率，描述分子在外電場中產(chǎn)生偶極矩的能力。q是分子振動的正常坐標(biāo)（描述原子運(yùn)動的集體模式）。

這個公式也為我們指出了增強(qiáng)拉曼信號的兩個主要途徑：提高激光功率和頻率，或者通過特殊方法改變分子的極化率特性。

然而，拉曼散射本質(zhì)上是一個極其微弱的光學(xué)過程。在所有入射光子中，大約只有10?6的光子會發(fā)生拉曼散射（相對于瑞利散射的發(fā)生概率），絕大部分光子都會發(fā)生彈性的瑞利散射。這種固有的弱信號特性使得在實(shí)際應(yīng)用中必須發(fā)展各種增強(qiáng)技術(shù)來提高檢測靈敏度，這也促進(jìn)了拉曼光譜技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新。

備注：拉曼與熒光信號強(qiáng)度存在巨大差距，熒光截面比普通拉曼大14個數(shù)量級，即使在共振拉曼條件下信號增強(qiáng)若干倍，熒光仍比共振拉曼強(qiáng)約8個數(shù)量級（108倍）。文獻(xiàn)中常見的"10-6"表述并不是和熒光散射截面比。這14個數(shù)量級的強(qiáng)度差異正是普通拉曼光譜信號微弱、極易被熒光"淹沒"的根本原因，也解釋了為何拉曼檢測需要特殊技術(shù)來抑制熒光干擾。

共振拉曼光譜是最重要的增強(qiáng)技術(shù)之一，其原理基于量子力學(xué)中的共振現(xiàn)象。當(dāng)激光頻率正好與分子的電子躍遷頻率匹配時，就像音叉的共振一樣，分子的響應(yīng)會被極大放大。從量子力學(xué)的角度來看，分子的極化率可以表示為。

在這個表達(dá)式中，當(dāng)激光頻率ω0接近電子躍遷頻率ωri時，分母趨近于零，導(dǎo)致極化率急劇增大，從而使拉曼信號獲得高達(dá)108倍的增強(qiáng)。

圖2 |分子有多個能量層級，光照射時發(fā)生能量跳躍：普通拉曼是分子快速"彈跳"能量微調(diào)，共振拉曼是光能量匹配某層級跳躍更強(qiáng)烈，熒光是分子跳到高層后慢慢返回發(fā)光。三種對應(yīng)光譜各有特征：吸收光譜（綠線）顯示分子吸收哪些光，發(fā)射光譜（紅線）顯示分子發(fā)出哪些光，拉曼光譜（淺綠）顯示光與分子振動的能量交換，共同構(gòu)成分子的"光學(xué)指紋"。

共振拉曼技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢不僅在于信號的大幅增強(qiáng)，更在于其選擇性特征。由于只有與特定電子躍遷耦合的振動模式才會被增強(qiáng)，這使得復(fù)雜分子的拉曼譜圖得以顯著簡化。研究者可以通過選擇不同波長的激光來選擇性地研究混合物中的特定分子，甚至可以研究分子激發(fā)態(tài)的結(jié)構(gòu)信息。

以鳥嘌呤-5'-磷酸核苷的研究為例，這種選擇性特征展現(xiàn)得淋漓盡致。當(dāng)使用532納米的非共振激光時，所有振動模式都會出現(xiàn)在譜圖中，使得譜圖變得相當(dāng)復(fù)雜難以解析。而當(dāng)改用244納米激光時，只有與π-π*電子躍遷相關(guān)的振動模式被選擇性增強(qiáng)，大大簡化了譜圖的復(fù)雜性。如果進(jìn)一步使用218納米激光，則會增強(qiáng)另一組不同電子躍遷相關(guān)的振動模式，為研究者提供了不同角度的分子信息。

圖3共振拉曼光譜的選擇性。（底部）鳥苷-5'-單磷酸的紫外/可見吸收光譜（結(jié)構(gòu)顯示在右側(cè)）。箭頭標(biāo)記了三種不同的激發(fā)波長，用于記錄拉曼光譜（頂部顯示）：532nm非共振拉曼光譜（右側(cè)），244nm（中間）和218nm（左側(cè)）共振拉曼光譜，涉及兩個不同的電子躍遷。

除了共振拉曼光譜，科學(xué)家們還發(fā)展了多種其他增強(qiáng)技術(shù)。表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)利用金屬納米顆粒的局域表面等離子體共振效應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)106到1014倍的驚人增強(qiáng)。

備注：106-1014倍增強(qiáng)，主要指的是散射截面的增強(qiáng)，而不是整個檢測系統(tǒng)的效率。實(shí)際檢測效率增強(qiáng)受綜合因素影響，通常遠(yuǎn)低于上述極限，視分子分布、表面活性、光學(xué)系統(tǒng)而變化，最常見的范圍是1/100到1/1000。

表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的發(fā)展

1974年，英國南安普敦大學(xué)的Fleischmann等人在進(jìn)行吡啶分子的電化學(xué)拉曼光譜研究時，意外觀察到銀電極上吡啶分子的拉曼信號異常強(qiáng)烈，增強(qiáng)了約10?倍。這個發(fā)現(xiàn)最初被歸因于電極表面電化學(xué)粗化導(dǎo)致的有效表面積增加，但1977年Jeanmaire和Van Duyne以及Albrecht和Creighton幾乎同時獨(dú)立證明，即使考慮表面積因素，仍存在10?-10?倍的"真正"增強(qiáng)效應(yīng)。這一認(rèn)識開啟了表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)技術(shù)的發(fā)展歷程，標(biāo)志著拉曼光譜學(xué)的重大突破。

圖4金屬納米粒子就像裝滿可移動電子的小球，當(dāng)光照射時，電子像海浪一樣集體有規(guī)律地來回振蕩，這種被"困"在粒子表面的電子集體振蕩就叫局域表面等離激元。當(dāng)振蕩頻率與光頻率匹配時，就像推秋千找準(zhǔn)節(jié)拍，電子振蕩變得特別劇烈，粒子周圍電場極大增強(qiáng)，這是表面增強(qiáng)拉曼光譜等技術(shù)的物理基礎(chǔ)。。箭頭表示電場。

SERS技術(shù)的增強(qiáng)機(jī)制源于兩個協(xié)同作用的物理過程。首先是電磁增強(qiáng)機(jī)制，它可以提供高達(dá)1011倍的信號增強(qiáng)。當(dāng)金屬納米顆粒在激光照射下激發(fā)局域表面等離子體時，這些等離子體就像天線一樣，在顆粒表面產(chǎn)生強(qiáng)烈的局域電場。電場增強(qiáng)因子為，其中g(shù)= (εi?ε0)/(εi+2ε0)，當(dāng)滿足等離子體共振條件時達(dá)到最大值。

圖5分子接近納米粒子表面時拉曼散射電磁增強(qiáng)機(jī)制的示意圖。

與電磁增強(qiáng)機(jī)制并行的是化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制，雖然增強(qiáng)倍數(shù)相對較小（102-103倍），但同樣重要。在這個過程中，分子與金屬表面形成化學(xué)鍵，產(chǎn)生新的電子躍遷態(tài)，類似于表面誘導(dǎo)的共振拉曼效應(yīng)。這兩種機(jī)制的結(jié)合使得SERS成為目前最強(qiáng)大的拉曼增強(qiáng)技術(shù)之一。

理想SERS基底的設(shè)計(jì)需要滿足嚴(yán)格的物理和化學(xué)要求。首先，基底材料必須是等離子體活性金屬，主要包括金、銀和銅。銀具有最佳的等離子體性質(zhì)，在可見光范圍內(nèi)損耗最小，但化學(xué)穩(wěn)定性較差；金的化學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)異，生物兼容性好，但等離子體響應(yīng)相對較弱；銅成本低廉，但容易氧化。

基底設(shè)計(jì)的科學(xué)原理和制備技術(shù)發(fā)展

基底的幾何結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)至關(guān)重要。納米顆粒間的間隙、尖端曲率半徑、表面粗糙度都直接影響電場增強(qiáng)效果。當(dāng)納米顆粒間距小于10納米時，會形成極強(qiáng)的"熱點(diǎn)"；尖銳的納米結(jié)構(gòu)通過"避雷針效應(yīng)"進(jìn)一步集中電場；適度的表面粗糙度（特征尺寸10-100納米）能夠激發(fā)多種等離子體模式，擴(kuò)大增強(qiáng)的光譜范圍。

SERS基底的制備技術(shù)經(jīng)歷了從簡單的電化學(xué)粗化到精密納米加工的發(fā)展過程。早期的電化學(xué)粗化方法簡單易行，但重現(xiàn)性差，增強(qiáng)效果不穩(wěn)定。納米球光刻技術(shù)通過單分散聚苯乙烯小球的自組裝，形成六方密堆積的掩膜，經(jīng)過金屬沉積和小球去除，制備出規(guī)整的納米三角形陣列，顯著改善了重現(xiàn)性。

圖6 |兩種新型SERS基底的例子。a)酶促生長的金屬顆粒；b)電子束光刻制造的基底。

電子束光刻技術(shù)能夠精確控制納米結(jié)構(gòu)的形狀、尺寸和排列，制備出性能可預(yù)測的SERS基底。雖然成本較高，但為基礎(chǔ)研究和高端應(yīng)用提供了理想的平臺。近年來發(fā)展的模板輔助方法利用陽極氧化鋁、二氧化硅膠體等作為模板，在降低成本的同時保持了結(jié)構(gòu)的規(guī)整性。

生物兼容制備方法的發(fā)展拓寬了SERS在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。酶促金屬沉積利用葡萄糖氧化酶等生物催化劑，在溫和條件下還原金屬離子，制備出形貌可控的納米結(jié)構(gòu)。DNA模板方法利用DNA分子的自組裝特性，引導(dǎo)金屬納米顆粒的定向排列，實(shí)現(xiàn)了生物分子水平的精確控制。

生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的突破

SERS技術(shù)正推動生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)生革命性變革，實(shí)現(xiàn)了從群體分析向單分子精準(zhǔn)檢測的跨越。該技術(shù)已具備單個細(xì)菌細(xì)胞檢測能力，空間分辨率達(dá)50×50 nm2，甚至可清晰識別單個病毒的蛋白質(zhì)外殼和RNA結(jié)構(gòu)，為新藥開發(fā)和抗藥性機(jī)制研究提供了前所未有的單細(xì)胞分析視角。

在分子診斷領(lǐng)域，通過創(chuàng)新的染料標(biāo)記策略，DNA序列檢測靈敏度達(dá)到10??-10?12M，為基因診斷和個性化醫(yī)療奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

更令人振奮的是，這些前沿技術(shù)正加速向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，基于SERS的血糖傳感器已在動物實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確穩(wěn)定的在線監(jiān)測，同時通過與微流控技術(shù)的深度融合，創(chuàng)造出僅需180 nL樣品的實(shí)驗(yàn)室芯片平臺，為臨床檢驗(yàn)、藥物研究和珍貴樣品分析提供了理想解決方案。

尖端增強(qiáng)拉曼技術(shù)的發(fā)展

針尖增強(qiáng)拉曼散射(TERS)技術(shù)代表了拉曼光譜技術(shù)發(fā)展的最新前沿。這項(xiàng)技術(shù)將SERS與原子力顯微鏡巧妙結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了同時獲得高空間分辨率和化學(xué)敏感性的目標(biāo)。TERS技術(shù)的空間分辨率可達(dá)20 nm，能夠檢測單分子水平的信號，成功突破了傳統(tǒng)光學(xué)衍射極限的限制。

這種技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要在原子力顯微鏡的探針尖端制備納米級的金屬結(jié)構(gòu)，形成高度局域化的電磁場增強(qiáng)區(qū)域。當(dāng)激光聚焦到這個微小區(qū)域時，只有探針尖端正下方幾十納米范圍內(nèi)的分子會產(chǎn)生增強(qiáng)的拉曼信號。這樣既保證了極高的空間分辨率，又提供了足夠的信號強(qiáng)度進(jìn)行化學(xué)分析。

TERS技術(shù)的發(fā)展為納米科學(xué)研究開辟了新的可能性。研究人員可以在納米尺度上研究材料的化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)，觀察單分子的化學(xué)反應(yīng)過程，甚至跟蹤生物大分子的構(gòu)象變化。這項(xiàng)技術(shù)在納米材料科學(xué)、表面化學(xué)和生物物理學(xué)等領(lǐng)域都展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

技術(shù)挑戰(zhàn)

盡管拉曼光譜技術(shù)發(fā)展迅速，但仍面臨重要挑戰(zhàn)。理論層面，經(jīng)典電動力學(xué)理論存在明顯局限：無法解釋轉(zhuǎn)動拉曼光譜的離散能級、難以完全描述共振拉曼和SERS的具體機(jī)理，且缺乏與分子軌道理論的直接聯(lián)系。

實(shí)驗(yàn)方面挑戰(zhàn)更為突出。共振拉曼技術(shù)受熒光干擾嚴(yán)重，因?yàn)闊晒饨孛姹壤⑸浯?4個數(shù)量級，強(qiáng)吸收還可能導(dǎo)致樣品熱分解和光化學(xué)反應(yīng)。SERS技術(shù)則面臨重現(xiàn)性差、定量分析困難以及增強(qiáng)機(jī)制難以分離等固有問題。

幸運(yùn)的是，這些挑戰(zhàn)正逐步得到解決。新型激光器和探測器提供更優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，SERS基底制備技術(shù)日趨穩(wěn)定，人工智能開始應(yīng)用于光譜數(shù)據(jù)解析，為技術(shù)發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。