GeIMA生物墨水打印的耳朵

GeIMA生物墨水打印的器官

生物3D打印，就如同切土豆的逆過程，即將土豆片、土豆絲、土豆丁及土豆泥反向組裝成土豆。然而，組裝出的土豆內(nèi)的細胞雖然有很好的活性，但這樣的土豆種到地里卻很難直接發(fā)芽（打印出的器官與體內(nèi)器官從功能上來說還有較大的差距），這種“形似而神不似”的問題正是當下生物3D打印面臨的瓶頸之一。

據(jù)記者了解，要想打印出既在外形結(jié)構(gòu)上相似，結(jié)構(gòu)內(nèi)的細胞又具有協(xié)同功能的組織器官并非易事。這不僅需要開發(fā)合適的活性“生物墨水”，還需要一臺能夠精準操控的3D打印設(shè)備。

近日，浙江大學機械工程學院教授賀永帶領(lǐng)的課題組發(fā)明了一種新型生物3D打印方法，該方法能夠操控細胞形成特定結(jié)構(gòu)的微球或微纖維，進而長成具有生物活性的微組織。相關(guān)論文先后刊登在SMALL雜志上。

不過，賀永對《中國科學報》記者坦言，很多人認為生物3D打印已經(jīng)無所不能，甚至覺得很快就可打印心肝腎肺等器官，實現(xiàn)器官移植，然而，事實上生物3D打印還遠未達到我們最初器官打印的設(shè)想，體外打印能夠用于移植的活性器官還有相當長的路要走。目前的生物3D打印，有兩個重要應(yīng)用，其一是構(gòu)造人體器官模型，從而為疾病機理研究、腫瘤的個性化治療等提供更為高效的手段；其二是為器官/組織的局部缺損、功能喪失等提供更高效的修復(fù)手段。

為體外重建器官提供新思路

生物3D打印也叫細胞打印，是指操縱細胞“生物墨水”構(gòu)造活性結(jié)構(gòu)的過程，而開發(fā)合適的生物墨水一直是生物3D打印中的一個核心問題。

賀永告訴記者，“生物墨水”首先要具備非常好的生物活性、類似體內(nèi)的細胞外基質(zhì)環(huán)境，便于打印后的細胞進一步發(fā)育，并建立細胞彼此間的通信。另外，在打印過程中還要求“生物墨水”必須具有很好的流動性，打印后能很快固化以便于固定成型。

甲基丙烯酸化水凝膠（GelMA）就是一種光敏性生物水凝膠，兼?zhèn)漭^強的可加工性和生物相容性，是組織工程、生物醫(yī)學、生物制造等領(lǐng)域的熱門材料。不過，GelMA的固化時間稍長（約3~5秒），同時載細胞的GelMA黏度較低，導(dǎo)致其直接制造難度較大。賀永教授課題組多年從事生物3D打印研究，已成功實現(xiàn)GelMA“生物墨水”及生物3D打印機的產(chǎn)業(yè)化。

“如果能高效實現(xiàn)GelMA微纖維的制造，就有望發(fā)展出基于微纖維的迷你組織?！笔艿叫K效應(yīng)的啟發(fā)，賀永課題組開發(fā)出了一種同軸生物打印技術(shù)。通過該技術(shù)，賀永課題組打印出包裹人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞的直血管和螺旋血管迷你組織，細胞在GelMA里可以增殖伸展并遷移。有趣的是，隨著培養(yǎng)時間的加長，內(nèi)皮細胞還遷移到了GelMA纖維外壁，并建立連接形成類似血管的內(nèi)皮管腔。

此外，賀永課題組還致力于構(gòu)建基于微球的迷你組織，他們將不同的細胞制成“生物墨水”，在一個微流控芯片噴頭的控制下，一點點“吐”出“墨水”。“在一股微氣流的吹動下，噴頭吐出的液滴不會馬上落下，而是旋轉(zhuǎn)起來，此時再根據(jù)數(shù)學建?？刂撇煌M分‘生物墨水’下降的方向，就能形成精致的立體結(jié)構(gòu)?！辟R永說，“這個過程有點像在轉(zhuǎn)動的蛋糕模具上裱花，讓不同細胞形成特定的立體‘編隊’。”賀永課題組用兩種分別混合了骨髓間充質(zhì)干細胞和人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞的“生物墨水”，同步打印出了螺旋形的微球，經(jīng)過幾天實驗室培養(yǎng)便形成了骨類器官。不僅如此，他們還在微球內(nèi)制造出螺旋面、玫瑰花、太極等復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)。

“這一技術(shù)的精度可以達到單細胞分辨率?！辟R永說，與現(xiàn)有生物制造方法相比，其特點是實現(xiàn)了在微小空間內(nèi)三維結(jié)構(gòu)的可控成型，為體外重建類器官、開發(fā)更為高效的器官芯片、實施更有效的細胞治療等，提供有效路徑。

主攻解決“神似”問題

目前，生物3D技術(shù)已經(jīng)從傳統(tǒng)僅注重結(jié)構(gòu)和形狀的制造，拓展到構(gòu)建體外細胞結(jié)構(gòu)體和生物裝置，并應(yīng)用于再生醫(yī)學、病理學、藥理學和藥物檢測模型，以及基于細胞和微流體裝置的細胞、組織、器官等高級生物和醫(yī)療器械產(chǎn)品。

此前在2018中國增材制造大會上，清華大學生物制造中心主任孫偉對《中國科學報》記者表示，細胞打印最關(guān)注三個問題：第一能不能打??；第二打印后能不能成型，不能形成孔結(jié)構(gòu)就沒有辦法把營養(yǎng)液放進去，打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部細胞就會死；第三把細胞活著打印出來之后，細胞能不能具有功能。

“生物3D打印的關(guān)鍵就是要注意選擇什么樣的噴頭、材料、黏稠度，才能使得這個細胞打出來后，至少保證90%以上的成活率?！睂O偉說，他們課題組就利用明膠和海藻酸鈉組合成“生物墨水”進行打印，這種“生物墨水”具有可以隨溫度而變化的趨勢，能夠通過調(diào)控溫度使得“生物墨水”在打印時延遲性最小。

實際上，清華大學從上世紀90年代末就開始從事生物3D打印的研究，清華大學生物制造中心教授徐弢還將生物3D打印應(yīng)用在了神經(jīng)科學領(lǐng)域。在生物3D打印神經(jīng)鞘管方面，他們團隊利用制造學的優(yōu)勢，通過打印微孔多通道結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管，在早期進行神經(jīng)生長因子灌注。植入3個月后發(fā)現(xiàn)，與未灌注神經(jīng)生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管相比，灌注有神經(jīng)生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管具有更好的促進組織再生的能力。

為了使得生物3D 打印的成果更加仿生，徐弢團隊還采用了“同軸打印+納米膜制造神經(jīng)纖維束”的方法，把神經(jīng)干細胞做成像線一樣的細胞線，線的中心是神經(jīng)干細胞，周圍包裹著的則是神經(jīng)的支撐細胞，這些細胞不斷地產(chǎn)生著營養(yǎng)因子。

“同軸打印的方式，即在中心打印神經(jīng)干細胞，在周邊打印支撐細胞，最終以條索狀的形式打印出來，然后將條索包裹起來。”徐弢表示，通過實驗發(fā)現(xiàn)，這種狀態(tài)下纖維束細胞的存活率相當高，而且也在一定程度上釋放出了神經(jīng)生長因子。

在賀永看來，生物3D打印的發(fā)展就是要解決“形似而神不似”的問題，實現(xiàn)生物3D打印的功能化突破和應(yīng)用。打印結(jié)構(gòu)后續(xù)的功能化是評價打印性能的金標準，也是生物3D打印的最終目的。

解決器官移植仍需時日

賀永告訴記者，細胞被水凝膠包裹的狀態(tài)，就如同果凍里面有一堆的水果丁，打印過程中，如果機械力、溫度等工藝控制不好，都會對細胞造成損傷。不過，目前生物3D打印的工藝已經(jīng)非常穩(wěn)定，細胞存活率基本都可以達到90%以上。

不過，他也同時指出，生物3D打印目前還只能打印一些比較簡單的組織，比如皮膚、血管等，要想實現(xiàn)打印出的肝臟等復(fù)雜器官同樣“神似”，實現(xiàn)復(fù)雜器官的全功能重建，至少還需要數(shù)十年的時間。

北京大學第三醫(yī)院教授余家闊也表示，雖然2015年3D打印的腎臟組織成功問世，但也僅是供醫(yī)學研究使用，不能真正應(yīng)用于器官移植，因為其安全性和實用性還有待探究，3D打印的器官在植入人體前還需經(jīng)過大量的實驗與數(shù)據(jù)分析。

余家闊認為，3D打印器官存在的困難主要包括打印材料以及細胞太過微小與脆弱，以及植入人體后能否自然銜接融合同時不產(chǎn)生排異反應(yīng)。他覺得，未來3D打印器官的趨勢將是以可吸收性生物材料作為載體、以細胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)，在體外構(gòu)成組織保護細胞。對于人體器官也將在研究其營養(yǎng)供應(yīng)與代謝的基礎(chǔ)上，解決經(jīng)3D打印技術(shù)培養(yǎng)出的組織體植入問題。

徐弢則表示，未來生物3D打印技術(shù)發(fā)展的機會越來越多，只有更多地與醫(yī)療、臨床和基礎(chǔ)科學相結(jié)合，才能形成多贏的局面。