在剛剛過去的蘇州標記免疫分析專業(yè)委員會2019學術峰會上，浙江清華長三角研究院分析測試中心蔡強主任詳細講述了分子診斷IVD設備的發(fā)展史。

蔡強：研究員、浙江清華長三角研究院分析測試中心主任、國家食品安全風險評估中心應用技術合作中心副主任

分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷在臨床診斷中的技術主要包括PCR技術、芯片技術和測序技術。臨床檢測中，分子診斷越來越受到重視，但市場占比與生化診斷、免疫診斷相比，還存在一定的差距。

目前分子診斷在體外診斷中的主要的應用領域，包括對病毒、細菌等微生物的篩查及定性定量檢測，藥物篩選及用藥分析以及基因早期的分析。在微生物檢驗檢測方面，分子診斷相對于免疫診斷具有一定的優(yōu)勢；基因圖譜分析方面，雖然目前相關研究很多，但在該領域應用的臨床價值還有待發(fā)掘。

分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷和微生物診斷存在一定的關聯(lián)性，微生物診斷是外部特性分析，而分子診斷則是對內部分子的檢測。

表1 分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷主要技術發(fā)展的時間軸

早期的分子診斷設備，多為大型集成化設備，包含很多的操作模塊。在原理上，早期的設備并無很多創(chuàng)新，主要是將多種手工操作內容自動化和集成化，發(fā)展到基因芯片，才有了原理性的突破。1990年提出的人類基因組計劃、后來的蛋白組學以及從近期開始的微生物組計劃，極大的推動了分子診斷設備的發(fā)展。產品方面，較早期時有Affymetrix公司推出的第一塊商業(yè)化基因芯片。

接下來是PCR儀器的發(fā)展。早期的PCR儀器，是簡單的DNA解鏈、復制、復性等過程，除了水浴鍋自動化，并沒有太多技術含量。數(shù)字PCR技術出現(xiàn)后， 與生物信息學和微型加工技術關聯(lián)起來，發(fā)展速度很快。再后來出現(xiàn)了微流控技術和基因測序技術?；驕y序技術經歷了一代、二代、三代，目前測序技術，仍然是重要的發(fā)展方向。

分子診斷主要技術發(fā)展的時間軸

前處理復雜導致分子診斷的現(xiàn)場應用成為瓶頸

分子診斷和免疫診斷、生化診斷設備不同的地方，很大程度在于樣品前處理。免疫檢測對象主要是一些游離的大分子，處理相對容易，但分子診斷樣本處在細胞當中，處理過程容易被污染，因此前處理系統(tǒng)相對復雜。

分子診斷系統(tǒng)的組成包括樣本前處理系統(tǒng)、檢測處理系統(tǒng)和分析處理系統(tǒng)。樣本前處理系統(tǒng)依據(jù)其功能的豐富程度又包括移液操作和核酸提取兩個平臺，依據(jù)使用場所不同分為實驗室自動化平臺和現(xiàn)場前處理平臺。

目前前處理設備中，全自動的移液工作站是比較成功的設備。它是一種全自動、高精度移液系統(tǒng)，專門用于小體積的PCR、qPCR體系配置，能夠完全替代手工，保證了配置實驗擴增體系的正確性、精密度及重復性。缺點是功能單一，臨床及科研應用尚有一定局限性。

貝克曼自動化工作站Biomek i7

核酸提取設備，主要是自動核酸提取儀，該儀器集成了自動移液工作站和標準耗材，在以其預設程序控制下進行核算分離的儀器，這一類自動化系統(tǒng)在科研和臨床中應用最為廣泛。提取方法的核心是免疫磁珠，包括磁珠吸附和磁珠分離等。除磁珠提取純化方法外，還有其他純化方法，如柱層析法。

托摩根核酸提取儀 MM96

目前，現(xiàn)場分子診斷還存在諸多問題。免疫檢測中可用試紙條等材料，檢測方便，但是分子診斷沒有這類材料可用，主要原因是樣品前處理無法達到這種檢測目的。當現(xiàn)場檢測時，在很開放的環(huán)境下，如何提取純化DNA，目前仍沒有簡易方法?，F(xiàn)場檢測的需求，目前在醫(yī)院的臨檢中心還不大，對于基層的衛(wèi)生所，或許會存在這樣的需求，從這個問題也引發(fā)出醫(yī)療模式應該往什么方向發(fā)展的思考。

分子診斷的三大檢測平臺

分子診斷主要的檢測平臺為PCR儀、芯片系統(tǒng)以及基因測序平臺。

PCR儀——數(shù)字PCR是未來發(fā)展趨勢

分子診斷設備另一個重要的組成內容是PCR儀器。常規(guī)的PCR目前技術上可提升的空間很有限，但很多部件只有少數(shù)幾家廠家做的不錯。

熒光定量PCR，國內有很多廠家生產，技術、元器件等各方面正在迅速趕超國外儀器廠商水平，但這未必是國內廠商最終的發(fā)展方向。得益于光源及檢測器件小型化趨勢，現(xiàn)在的熒光PCR儀越來越小型化。

數(shù)字PCR是PCR領域未來發(fā)展的趨勢，目前有一些廠商在研究生產，比如銳訊生物、新羿生物、領航基因等。現(xiàn)在數(shù)字PCR的售價很高，主要原因是后端檢測器件靈敏度要求高，成像器件技術先進，造成成本偏高。當然，因為數(shù)字PCR有絕對定量的功能，對于分子檢測意義重

微滴式數(shù)字PCR的檢測流程

表2 3種PCR的比較

DNA微陣列——基因芯片

熒光原位雜交（FISH），是一種傳統(tǒng)方法，對于原位切片的分析有一定的意義。儀器本身比較簡單，就是熒光顯微鏡，外加一個殼構成的一個圖像分析儀。檢測過程是在一定的溫度下將切片加入設備中，成像。雜交的另一種方式是利用芯片進行，主要是DNA微陣列芯片。芯片技術從上世紀90初期開始研究到現(xiàn)在，已經有近三十年時間，目前已經應用到診斷當中，用做疾病篩查。熒光原位雜交最核心的地方在于診斷試劑而非設備。目前的檢測方式主要采用熒光標記的方式，在靈敏度方面，已經能夠滿足檢測要求，因此化學發(fā)光、電化學發(fā)光標記方式相對較少。

美谷分子GenePix 4300A&4400A微陣列基因芯片掃描儀

第四代基因測序成為資本追逐熱點

基因測序的發(fā)展，從最早獲得諾貝爾獎的一代，到現(xiàn)在已經發(fā)展到第四代。原理上，第一代測序儀可認為是人工操作方法的儀器實現(xiàn)，相對比較簡單?，F(xiàn)在的第三代測序和第四代測序的原理已有一定區(qū)別。目前，高通量測序的需求很大，發(fā)展很迅速，國內在基因測序儀器的發(fā)展也將會越來越快。第三代和四代測序儀的價值在于直接讀取功能大，但成本很高，測序時間長。把測序降到10美元以下是全球相關企業(yè)追求的目標，如果實現(xiàn)，測序在診斷中的應用將會更多的取代其他技術。

四代測序，即納米孔技術測序，目前已經成為資本市場追逐的熱點，容量約為幾十億美元。原理很簡單，就是DNA鏈打開后穿過一個很細的孔，單個堿基對通過納米尺寸的通道時，會引起通道點穴性能的變化。四代測序具有高讀長、易集成、小型化、高速度、大通量等優(yōu)勢。納米孔所通電流很小，為10-18-10-15A，遠低于熒光檢測電流，所以目前檢測時間大約需要幾個小時到十幾個小時，隨著技術的不斷進步，后期有望將測序時間縮短到半小時。

納米孔主要包括兩大類生物納米孔和固態(tài)納米孔。生物大分子納米孔發(fā)展較早，已經有了相應的設備，體積很小，準確率較低。固態(tài)納米孔，目前還是實驗室水平，有少數(shù)四代測序公司已經開始做固態(tài)納米孔測序儀。固態(tài)納米孔的檢測方式很多，在基底上做一些材料摻雜，具有半導體特性，可替代光學器件，精確度也等性能指標更好。因為固態(tài)納米孔使用的是標準的微電子工藝，如果可以規(guī)?；a，可以降低測序儀生產成本，值得推廣。

測序結束后，數(shù)據(jù)處理比其他診斷方法更為復雜。免疫檢測的IVD設備后期用到的主要是數(shù)據(jù)庫管理，無需數(shù)據(jù)處理，但是分子診斷數(shù)據(jù)需要用算法進行處理，這些算法也就是生物信息學的發(fā)展源頭。目前來講，做算法的人才和做軟件的人才都并不缺乏，缺乏的是能夠將算法做成軟件的人才，這是基本事實。目前很多高校已經發(fā)表了很多算法相關的論文，但是軟件依舊很少。目前很多檢測機構所用的數(shù)據(jù)分析軟件多是英文軟件，很多還是開源軟件，這種軟件不適合醫(yī)院檢驗使用。因此，數(shù)據(jù)處理軟件不足，對測序設備在臨床的應用是個非常棘手的問題。

除了上述測序技術，DNA條形碼與測序結合起來，未來在臨床上或可發(fā)揮一定的作用。DNA條形碼是利用標準的、有足夠變異的、易擴增、較短的DNA片段在物種內的的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識別系統(tǒng)。目前主要用于物種鑒定。