藥物療效的臨床前分析是藥物開發(fā)的關(guān)鍵。然而，傳統(tǒng)的群體細(xì)胞分析只能靜態(tài)評(píng)估平均群體行為，對(duì)藥物逃逸細(xì)胞的分辨率較低。而對(duì)療效的不準(zhǔn)確評(píng)估，往往要么導(dǎo)致高估候選藥物的療效，但無(wú)法在臨床得到證實(shí)，要么則導(dǎo)致有價(jià)值的候選藥物被拒。延時(shí)微流控顯微鏡是一種高時(shí)空分辨率的藥物表征方法，但目前還難以大規(guī)模應(yīng)用。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，法國(guó)巴黎大學(xué)（Université de Paris）的研究人員報(bào)道了一種以液壓氣動(dòng)機(jī)制運(yùn)行的模塊化微流控細(xì)胞培養(yǎng)室，其特點(diǎn)是具有特別高的縱橫比。通過(guò)復(fù)制該功能單元，并將其與雙入口微流控稀釋系統(tǒng)相結(jié)合，研究人員得到了一個(gè)可以同時(shí)設(shè)置五種藥物濃度條件的微流控平臺(tái)。

該微流控平臺(tái)由兩個(gè)入口和一系列蛇形微通道組成，這些微通道依次通過(guò)五個(gè)獨(dú)立的腔室組實(shí)現(xiàn)對(duì)流入溶液的滴定。最終，通過(guò)寬視場(chǎng)倒置顯微鏡對(duì)這些腔室進(jìn)行時(shí)間分辨觀測(cè)，研究人員能夠直接捕捉到單個(gè)分枝桿菌細(xì)胞在給藥前、給藥中和給藥后的生長(zhǎng)情況、死亡率和存活率。

圖1 連接到多通道微流控流量控制器（Fluigent）的五條件微流控裝置示意圖。第一個(gè)通道首先連接到三個(gè)獨(dú)立的儲(chǔ)液池，隨后依次連接到一個(gè)由軟件控制的雙向位置閥，以實(shí)現(xiàn)不同濃度條件的切換。

生成不同的梯度模式來(lái)模擬藥物動(dòng)力學(xué)

如圖2a所示，為了在五條件微流控平臺(tái)中產(chǎn)生濃度梯度，研究人員從進(jìn)樣口注入兩種不同的溶液，使之分別流入兩個(gè)獨(dú)立的蛇形微通道。隨后，后者分叉為外部和內(nèi)部?jī)蓚€(gè)蛇形微通道，其中外部蛇形微通道中的溶液保持原來(lái)的濃度，而內(nèi)部的蛇形微通道充當(dāng)混合器，使流入的溶液在此混合。

接著，三個(gè)蛇形微通道中的每一個(gè)都繼續(xù)分叉，產(chǎn)生兩個(gè)外部蛇形微通道和兩個(gè)混合器，之后進(jìn)一步分叉并產(chǎn)生最后一個(gè)包含兩個(gè)外部蛇形微通道和三個(gè)內(nèi)部混合器的稀釋水平。在每個(gè)稀釋水平下，蛇形微通道內(nèi)的流量是相同的，而在每個(gè)分支的連接部分，流向系統(tǒng)外部的流量更大，流向系統(tǒng)內(nèi)部的流量更小。

這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的濃度梯度是線性的。從最后一個(gè)稀釋水平開始，溶液流入五個(gè)獨(dú)立的腔室組（C1-C5），每個(gè)腔室組有四個(gè)微腔室。最后，每組腔室連接到相同的出樣口，以最大限度地提高整個(gè)微系統(tǒng)的流動(dòng)穩(wěn)定性。

圖2 五條件平臺(tái)的梯度構(gòu)造表征

此外，為了量化濃度梯度，研究人員將溶入異硫氰酸熒光素（FITC）的7H9培養(yǎng)基溶液注入第一個(gè)進(jìn)樣口，并將不含熒光的7H9培養(yǎng)基溶液注入第二個(gè)進(jìn)樣口。研究發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)態(tài)下，測(cè)得的梯度與理論預(yù)期相差最小，此時(shí)，F(xiàn)ITC溶液在C1中未稀釋，在C2中稀釋到約72%，在C3中稀釋到約48%，在C4中稀釋到約25%，在C5中不存在。

為了模擬典型的PK曲線，研究人員還生成了脈沖形的FITC梯度，其峰值濃度與靜態(tài)梯度得到的濃度不同。其中，F(xiàn)ITC溶液在峰值濃度時(shí)，其在C1中未稀釋，在C2中稀釋到約82%，在C3中稀釋到約54%，在C4中稀釋到約21%，在C5中不存在。

通過(guò)雙向開關(guān)閥，在不同時(shí)間間隔交替灌注非熒光和熒光溶液，可以產(chǎn)生靜態(tài)和動(dòng)態(tài)梯度。有趣的是，只有在進(jìn)樣口上游集成了電容時(shí)，才能獲得模擬PK的脈沖形梯度。總之，通過(guò)將稀釋樹網(wǎng)絡(luò)與微流控培養(yǎng)室集成，研究人員創(chuàng)建了一個(gè)適合在空間和時(shí)間上滴定分子的微流控平臺(tái)。

莫西沙星對(duì)恥垢分枝桿菌微菌落的作用具有劑量和時(shí)間依賴性

為了測(cè)試平臺(tái)的運(yùn)行，研究人員研究了不同藥物濃度對(duì)恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)速度的影響。其中，研究人員重點(diǎn)研究的莫西沙星是一種靶向II型拓?fù)洚悩?gòu)酶DNA旋轉(zhuǎn)酶的氟喹諾酮類藥物，其在抗擊多藥耐藥菌株的抗結(jié)核治療過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為了監(jiān)測(cè)莫西沙星對(duì)靶標(biāo)的影響，研究人員通過(guò)將系統(tǒng)中的mCherry基因與GyrA染色體融合，生成了GyrA的紅色熒光報(bào)告基因。

研究發(fā)現(xiàn)，在不存在莫西沙星的情況下，細(xì)菌呈指數(shù)級(jí)生長(zhǎng)，但隨著藥物濃度的增加，細(xì)菌的微菌落大小顯著地逐漸減小，在最高濃度時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)迅速停止。且與未給藥的細(xì)胞相比，研究人員觀察到最高濃度的莫西沙星顯著抑制靶標(biāo)，而較低濃度的莫西沙星會(huì)誘導(dǎo)靶標(biāo)。

此外，在給藥的前6小時(shí)，研究人員沒(méi)有測(cè)量到在不存在藥物或存在不同濃度藥物的情況下微菌落生長(zhǎng)速率的顯著變化。而在給藥的最后6小時(shí)，微菌落生長(zhǎng)速率開始顯著放緩，并在無(wú)藥物的恢復(fù)階段繼續(xù)下降。此外，研究人員觀察到在相同給藥濃度下，克隆微菌落生長(zhǎng)速度存在顯著異質(zhì)性。

最后，研究人員檢驗(yàn)了體外模擬的PK參數(shù)與生長(zhǎng)速率是否相關(guān)。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給藥濃度高于最小抑制濃度（MIC）時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)速率與劑量（R2 = 89.8%）和時(shí)間（R2 = 90.8%）之間都存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。相比之下，研究人員發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)速率與曲線下面積（AUC）和MIC的比值之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。

總之，研究人員利用該微流控平臺(tái)在高細(xì)胞分辨率下分析了PD性質(zhì)以及PD-PK關(guān)系，發(fā)現(xiàn)莫西沙星對(duì)恥垢分枝桿菌微菌落的作用具有劑量和時(shí)間依賴性。

圖3 莫西沙星脈沖梯度對(duì)恥垢分枝桿菌GyrA-mCherry報(bào)告基因的作用

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)工作是首個(gè)用于生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌細(xì)胞的單細(xì)胞劑量-反應(yīng)試驗(yàn)的概念驗(yàn)證工作，該研究中創(chuàng)建的微流控平臺(tái)具有良好的在高時(shí)空分辨率下研究PK-PD關(guān)系的能力。此外，與間接推斷藥物耐受細(xì)胞存在的群體細(xì)胞分析方法不同，該微流控平臺(tái)允許直接檢測(cè)不同的單細(xì)胞在藥物作用下隨時(shí)間的變化，為藥物發(fā)現(xiàn)提供技術(shù)進(jìn)步。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41598-022-24175-9

審核編輯：劉清