多肽、蛋白質(zhì)和抗體等生物制劑是過去十年中增長最快的藥物類別。與小分子相比，它們具有較低的毒性、較高的結(jié)合親和力和特異性，以及較好的藥代動力學。然而，在藥物開發(fā)過程中，許多此類化合物可能由于早期階段就存在的溶解度差的問題，從而在晚期階段導致代價高昂的藥物開發(fā)失敗，或者開發(fā)出來的產(chǎn)品在使用時缺乏便利性。例如，一些開發(fā)出來的生物制劑產(chǎn)品是以凍干形式進行儲存，因此需要在給藥前溶解，并通過靜脈而不是皮下進行給藥，這可能導致每次給藥都需要去醫(yī)院進行長時間的就診，而無法實現(xiàn)居家給藥。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近期，英國劍橋大學（University of Cambridge）的研究人員提出了一種微流控平臺，可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)相對溶解度的測量。該微流控平臺僅需利用20 μg純化蛋白質(zhì)，即可獲得超過10000個數(shù)據(jù)點，并最終實現(xiàn)對蛋白質(zhì)溶解度的低成本、高通量測量。與以往的方法相比，該方法使得可獲取的數(shù)據(jù)點增加了1000倍，同時所需材料減少了10倍以上。這種超高通量的方法可以在一個實驗中優(yōu)化多個變量。因此，該微流控平臺具有簡化藥物開發(fā)過程的潛力，并可以大大增加研究人員對生物制劑的溶解度和輔料效果的認知。相關(guān)研究成果以“Multidimensional Protein Solubility Optimization with an Ultrahigh-Throughput Microfluidic Platform”為題，發(fā)表于Anal. Chem.期刊。

圖1 在超高通量聚集試驗中測量蛋白質(zhì)溶解度的微流控平臺

研究人員首先利用微流控技術(shù)生成了數(shù)千個含有蛋白質(zhì)、輔料和沉淀劑的微液滴。通過調(diào)節(jié)含有蛋白質(zhì)、緩沖液、聚乙二醇（PEG）和選定輔料的溶液的流速，可以創(chuàng)建一系列具有不同物質(zhì)成分比例的微液滴。隨后將熒光染料（游離于溶液中作為條形碼或與蛋白質(zhì)結(jié)合）添加到溶液中。將生成的微液滴“孵育”5分鐘后，在與所添加的熒光染料相對應的波長下進行成像，即可以從熒光強度推斷出液滴中化合物的濃度。此外，由于蛋白質(zhì)帶有熒光標記，研究人員可以通過直接觀察來判斷蛋白質(zhì)是均勻地分布在液滴中，還是形成了沉淀物。如果蛋白質(zhì)形成了沉淀物，液滴中會顯示出明亮的光譜。

接著，研究人員對藥物制劑配方中常用的輔料（例如氯化鈉（NaCl）、組氨酸、精氨酸、蔗糖以及聚山梨酯20和80）在增加蛋白質(zhì)溶解度方面的效果進行了量化研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正如在理想狀態(tài)下所預期的那樣，在給定的濃度范圍內(nèi)，輔料可以線性提高蛋白質(zhì)的溶解度。通過比較圖2中顯示的白色邊界的斜率，研究人員可以對這些輔料增加蛋白質(zhì)溶解度的能力進行排名。此外，除了比較曲線的斜率，還可以利用曲線下面積（AUC）對這些輔料進行定量地對比。利用圖2中的測量值，研究人員可以合理地設計一種配方來提高所研究的蛋白質(zhì)的溶解度。

圖2 常用輔料的配方優(yōu)化示意圖

此外，使用該微流控平臺，研究人員還可以在一項實驗中以高分辨率研究不同輔料的組合效果，從而在優(yōu)化配方時節(jié)省額外的時間和材料。另外，pH值是影響蛋白質(zhì)溶解度的另一個重要因素，因此，研究人員使用微流控平臺對該影響因素進行了探索。研究人員分別測量了牛血清白蛋白（BSA）在處于pH = 4、5、6、7、8和9的緩沖環(huán)境的制劑中的溶解度（圖3b）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH = 4時，BSA的相對溶解度為9.7% ± 0.3% PEG，在pH = 5時，BSA的相對溶解度為6.7% ± 0.4% PEG。因此，如果只考慮溶解度，pH = 4的配方更優(yōu)。此外，增加pH值也可以顯著提高溶解度，當pH = 9時，BSA的溶解度非常高，以至于在該實驗條件下無法確定BSA的溶解度數(shù)值。此外，值得注意的是，與以往的測量方法相比，圖3所示的基于微流控平臺的測量方法需要的蛋白質(zhì)量減少了90%，“孵育”時間也從2天顯著減少為5分鐘，并且由于測量過程中可以獲得數(shù)千個數(shù)據(jù)點而不是僅僅幾十個數(shù)據(jù)點，采用微流控平臺的測量方法，其測量誤差更小。

圖3 不同配方輔料組合的對比和pH值的優(yōu)化

另一種提高蛋白質(zhì)溶解度的方法是使蛋白質(zhì)發(fā)生突變，以獲得更多的可溶性突變體，同時保持其所需的其它功能。該研究所提出的微流控平臺可以成功用于測量蛋白質(zhì)突變體的溶解度。圖4a顯示了野生型IgG4抗體和研究人員所設計的六個突變體的結(jié)構(gòu)。研究人員首先利用CamSol方法對這些突變體的相對溶解度進行了預測，預測結(jié)果顯示，突變體1~3比野生型IgG4抗體的溶解度低，而突變體4~6比野生型IgG4抗體的溶解度高（圖4b）。隨后，研究人員利用該微流控平臺對突變體和野生型IgG4抗體的溶解度進行了測量，測量結(jié)果顯示，突變體1~3確實具有較低的相對溶解度，而突變體4~6具有較高的溶解度。值得注意的是，完整的IgG4抗體具有約1350個殘基，而這些突變體僅存在2~4個突變點，即使在這樣的情況下，該微流控平臺也可以有效地選擇出溶解度更高的突變體，從而有效優(yōu)化蛋白質(zhì)序列。

圖4 IgG4抗體和六種突變體的溶解度測量

總體而言，優(yōu)化蛋白質(zhì)的溶解度仍然是開發(fā)基于蛋白質(zhì)的藥物的重大挑戰(zhàn)。然而，現(xiàn)有技術(shù)對材料的要求很高，并且沒有足夠的通量來測量早期開發(fā)過程中的蛋白質(zhì)溶解度或廣泛優(yōu)化配方。該研究提?出了一個可以同時解決這兩個問題的微流控平臺。該微流控平臺可以量化通過加入不同種類和不同濃度的配方輔料所獲得的蛋白質(zhì)溶解度的提升效果，并優(yōu)化pH值以提高蛋白質(zhì)藥物的溶解度。此外，該方法可以對蛋白質(zhì)突變體進行準確的溶解度排序，即使這些突變體僅存在幾個突變點。因此，該微流控平臺提供了一種高度定量的策略，可用于改善影響蛋白質(zhì)溶解度的各個因素，并有助于開發(fā)新的基于蛋白質(zhì)的藥物。

審核編輯：劉清