本文提出一種微腔式數(shù)字PCR微流控芯片。作者將兩層微結(jié)構(gòu)背對(duì)背堆疊在一起使得在不改變芯片平面面積的情況下使腔室數(shù)量和試劑容量增加一倍，極大提升了檢測(cè)靈敏度。同時(shí)將碳黑粉末混合到純PDMS中以阻礙熒光從芯片兩層之間的陽(yáng)性腔通過(guò)，這使得芯片不同層微腔的熒光信號(hào)采集互不干擾。

圖 1

如圖 1 所示，該芯片由四層組成：頂層和底層透明玻璃片為擴(kuò)增時(shí)防蒸發(fā)和信號(hào)收集窗口；中間兩層為兩個(gè)帶有通道和反應(yīng)腔的背對(duì)背PDMS層(見(jiàn)圖2芯片澆筑)。中間兩層結(jié)構(gòu)采用相同的模具制造，并與入口/出口孔連接。

圖 2

芯片PDMS層澆筑如圖2所示。光刻流程過(guò)于簡(jiǎn)單，此處不再描述。

黑色PDMS的制作方法：將預(yù)混好的 10:1 PDMS 與碳黑粉末以0.8%的質(zhì)量百分比混合。然后，將混合物在真空中脫氣再以正常流程操作即可。既假設(shè)預(yù)混PDMS為100g，則需碳黑粉末為100g × 0.008 = 0.8g。

采用黑色PDMS的目的為阻礙熒光信號(hào)從芯片兩層之間的陽(yáng)性腔穿過(guò)。這使得芯片不同層微腔的熒光信號(hào)采集互不干擾。

圖 3

圖3所示為芯片PDMS結(jié)構(gòu)層設(shè)計(jì)的一系列沿主通道兩側(cè)均勻分布的圓柱形反應(yīng)腔放大圖。

圓柱形反應(yīng)腔直徑為 87 μm，高度為 120 μm。主通道的高度為 50 μm，寬度為 60 μm。與圓柱形反應(yīng)腔和主通道相連的分支通道的寬度和長(zhǎng)度為25μm，高度為60μm。

芯片每一層包含 21,384 個(gè)獨(dú)立的 0.71 nL 圓柱形反應(yīng)腔，因此芯片可以輸送超過(guò) 30 μL 的試劑。

圖 4

芯片尺寸為35×20 mm，芯片實(shí)物如圖4所示。

芯片操作流程如圖5所示，依次完成芯片抽真空、試劑加載和分配過(guò)程。隨后將芯片轉(zhuǎn)移至平板PCR儀進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)。

圖 5

作者對(duì)比了本文提出的單層結(jié)構(gòu)和雙層結(jié)構(gòu)芯片的靈敏度。其中，一層芯片包含23,184個(gè)反應(yīng)腔。

雙層芯片與單層芯片在檢測(cè)靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍方面的比較如表1所示。

雙層數(shù)字PCR芯片的檢測(cè)限較低，因?yàn)榍皇覕?shù)量增加了一倍。由于腔室數(shù)量增加，檢測(cè)上限也增加。因此，雙層數(shù)字PCR芯片的動(dòng)態(tài)范圍是單層芯片的兩倍以上。

審核編輯：劉清