文章來源：老千和他的朋友們

原文作者：孫千

本文介紹了共聚焦拉曼顯微鏡。

“拉曼光譜是一種弱散射技術(shù)，通常不到百萬分之一的激發(fā)光子會產(chǎn)生一個拉曼光子。這種情況在共聚焦拉曼顯微鏡中更加困難，因為探測體積被小針孔縮小，必須在短時間內(nèi)收集成千上萬的光譜。因此，精細(xì)的設(shè)計激發(fā)和探測光學(xué)器件，以及適當(dāng)選擇光譜儀和探測器對于成功的實驗非常重要。”

1引言

拉曼散射通常是一種非常微弱的效應(yīng)，因為激發(fā)的光子與參與散射過程的分子之間存在非諧振的相互作用。因此，在一個給定的測量幾何中，拉曼光子的數(shù)量是有限的，任何提高光子收集效率的技術(shù)進步都是非常重要的。盡管拉曼效應(yīng)在1928年已經(jīng)由Chandrasekara-Raman發(fā)現(xiàn)（兩年后被授予諾貝爾物理學(xué)獎），但常規(guī)的拉曼光譜實驗直到1960年代激光的發(fā)展才得以實現(xiàn)。

在20世紀(jì)70年代和80年代，電荷耦合器件（CCD）的發(fā)展取代了光電倍增管（PMT），實現(xiàn)了多通道探測。WillardS. Boyle和George E. Smith因發(fā)明了CCD相機而獲得2009年諾貝爾物理學(xué)獎。

由于硅探測器在光譜的可見和近紅外區(qū)域與PMT相比具有更高的量子效率（QE），而且CCD可以作為線性探測器使用，這使得測量時間至少減少了三個數(shù)量級。以前，感興趣的拉曼波段必須在一個PMT上掃描，一個點探測器只對光譜儀出口狹縫所選擇的非常窄的波長范圍敏感。隨著CCD的引入，光譜儀的出口狹縫可以由一個線性CCD探測器重新放置，從而可以同時采集超過1000個通道。

2拉曼顯微鏡的發(fā)展

在90年代，一些公司首次將拉曼光譜儀與光學(xué)顯微鏡結(jié)合起來，光學(xué)顯微鏡被用來將激發(fā)光聚焦到一個直徑為幾微米的小點上，以便從更小區(qū)域獲得拉曼光譜。這是第一次從直徑只有幾微米的區(qū)域中獲得拉曼光譜。物高NA的物鏡對拉曼信號的高效率收集有好處，另一方面，當(dāng)人們把光聚焦到一個小區(qū)域或點上時，必須注意不要用過于強烈的激光束加熱樣品和熱破壞它。

在另一種方法中，光鏡—拉曼聯(lián)用儀器配有步進電機驅(qū)動的定位臺，以光柵掃描樣品并收集拉曼光譜，這種被稱為拉曼光譜的技術(shù)可以用來從每個光譜中提取相關(guān)的化學(xué)信息，并以幾微米的橫向分辨率繪制樣品中化學(xué)成分的分布圖。

由于使用這些儀器采集典型的拉曼光譜可能需要幾秒鐘的積分時間(或者甚至更長，取決于所需的信噪比和樣品的散射效率)，一般認(rèn)為這種技術(shù)非常慢，并且采集樣品的拉曼圖需要幾個小時。如果使用每個頻譜僅1秒的積分時間，則60×60像素拉曼圖僅積分就需要60×60=3600s，1h。加上用步進電機定位樣品所需的時間，以及CCD的讀出時間和反向掃描的時間，該實驗所需的總時間很容易就會增加一倍。

保持系統(tǒng)穩(wěn)定，并在這一時間尺度上獲得優(yōu)于1微米的精度是一個挑戰(zhàn)，60X60像素的地圖只是一個很小的圖像，如果是200×200 = 40000像素光譜圖，在每個頻譜的積分時間不顯著降低的情況下，生成拉曼圖幾乎是不可能完成的任務(wù)，只有每個光譜的積分時間必須減少到100毫秒甚至更少才行。

因此，開發(fā)了多路設(shè)置來提高采集速度，類似于從單點、零維PMT到一維CCD的轉(zhuǎn)換。

一種想法是照射一條完整的線，并將這條線投射到光譜儀的入射狹縫上并掃描整個樣品。CCD相機的垂直軸可用于位置信息，水平軸用于能量分散。利用這種技術(shù)，人們可以同時獲得沿著照明線的數(shù)百個光譜，這種技術(shù)被稱為“線成像”。

另一種方法是將光通過(可調(diào)諧的)窄帶濾光片發(fā)送到成像CCD上，從而將樣品作為一個整體均勻照射，并在沒有分光計的情況下獲取所需的光譜信息。單次曝光收集整個樣品的拉曼光，并且不再需要掃描。這種模式不可能在每個圖像點收集完整的拉曼光譜，相反，光譜信息必須通過在不同的濾波器通帶位置拍攝幾幅圖像來獲得，這種技術(shù)被稱為“全局成像”。

盡管這些技術(shù)將探測速度提高了幾個數(shù)量級，但它們具有嚴(yán)重的缺點，在大多數(shù)情況下妨礙了它們的有用應(yīng)用。一個主要的缺點是這兩種技術(shù)都不是共焦的，因此要么有狹縫而不是圓形針孔，要么根本沒有針孔。

“共焦”被定義為“具有相同的焦點”，其中用點光源照射樣品，并通過探測器前面的針孔探測該點的圖像。照明點光源和針孔都位于同一焦平面上。通過在樣品上逐點和逐行掃描激光焦點，或者通過在激光點下掃描樣品，可以獲得樣品的圖像。由于信號是通過針孔探測的，因此只有來自焦平面的光才能到達探測器。在焦平面之上或之下發(fā)射的光在針孔平面中沒有聚焦，因此對圖像沒有貢獻。

3共焦

拉曼光譜的最大干擾因素是熒光。由于熒光是光與電子樣品態(tài)的共振相互作用，熒光的效率可以很容易地比拉曼相互作用的效率高6個數(shù)量級。如果樣品在用于拉曼的激發(fā)波長下顯示熒光，在大多數(shù)情況下，熒光強度如此之高以至于不能探測到拉曼信號。

因此，通過使用不顯示樣品熒光的激發(fā)波長，或者減少探測體積，盡可能減少熒光背景是極其重要的。

不幸的是，不可能總能找到?jīng)]有熒光的激發(fā)波長，因為與拉曼散射相比，熒光過程效率高。在這些情況下，共焦探測裝置將熒光的收集限制在從焦平面發(fā)射的光子，這將急劇地減少熒光背景信號，從而在許多情況下可以獲得拉曼圖像。如果熒光是由雜質(zhì)而不是樣品本身引起的，共焦拉曼圖像通常給出非常有用的結(jié)果，而非共焦技術(shù)仍然會從焦平面上方和下方的區(qū)域收集的過多的熒光。

由于共焦探測原理將探測到的光限制在焦平面上，所以它還可以進行3D和透明樣品的光學(xué)截面分析（不將樣品切成兩半）。如果樣品是支撐基底上的薄層，共焦設(shè)置允許樣品信號與背底信號分離。比如，蓋玻片(170μm厚)上厚度小于1μm的聚合物樣品，產(chǎn)生的拉曼信號比玻璃基材本身小100倍以上，非共焦技術(shù)幾乎無法進行分析。

非共焦技術(shù)或許有其獨特的應(yīng)用，但共焦技術(shù)在空間分辨率和背景抑制方面可提供最佳的結(jié)果。

4共焦拉曼顯微鏡的通量

因為拉曼信號非常弱，所以優(yōu)化共焦拉曼顯微鏡的通量以在短時間內(nèi)進行共焦拉曼成像是非常重要的。圖1顯示了由激發(fā)激光器、顯微鏡和帶有CCD探測器的光譜儀組成的典型拉曼顯微鏡系統(tǒng)示意圖。樣品的掃描運動由壓電掃描器執(zhí)行，當(dāng)配備位置傳感器時，該掃描器非常快速且極其精確。

為了優(yōu)化拉曼信號，系統(tǒng)的每個部分都必須針對最高的傳輸和效率進行優(yōu)化。如果元件選擇不當(dāng)，靈敏度很容易下降一個數(shù)量級。如果需要單個光譜，通常所需的積分時間是1s還是10s并不重要，但如果一幅圖像需要15分鐘或2.5小時，則差別很大。

圖1帶有光纖耦合激光源和光譜儀的拉曼顯微鏡的典型

4.1激光的波長

拉曼散射強度正比于ν4，ν是激發(fā)激光輻射的頻率。因此，400nm的激光比800nm的激光產(chǎn)生高16倍的拉曼信號。另一方面，許多樣品在紫外或藍色區(qū)域被激發(fā)時具有強熒光，而在紅色或NIR區(qū)域被激發(fā)時具有低熒光。

激發(fā)波長越短，橫向分辨率越高，因為分辨率由下式給出d=0.61λ/NA，d是兩點之間最短的可分辨距離，λ是波長，NA是所用物鏡的數(shù)值孔徑。這個關(guān)系也表明數(shù)值孔徑同樣重要。在400到900 nm的范圍內(nèi)，高NA物鏡容易獲得。350 nm以下的UV波長，拉曼散射高，但可用物鏡數(shù)量有限。此外，高能量光子會造成樣品損壞，也成為一個問題。在長波長下，橫向分辨率降低，拉曼效率大幅下降，但熒光不太可能出現(xiàn)。

適用于拉曼顯微鏡的激光器應(yīng)該具有：高斯光束形狀，可以聚焦到衍射受限的點；線性偏振，以允許觀察偏振相關(guān)的樣品特性；具有遠低于1cm-1的窄線形，以避免加寬拉曼譜線；頻率穩(wěn)定(變化<0.01cm-1)，以允許高精度的應(yīng)力測量；強度穩(wěn)定(<1–2%的功率波動)，以實現(xiàn)精確和濃度的測量。

另外，拉曼信號與激發(fā)功率成正比，但可接受的激光功率取決于激光波長、樣品特性(吸收、導(dǎo)熱性等)和其他成像條件(激光焦點直徑等)。功率可以從uW變化到幾百mW。如果樣品是透明的，對于300 nm的光斑尺寸，綠色激光可接受的功率約是10 mW。

4.2物鏡

為了獲得最高的收集效率和最佳的空間分辨率，應(yīng)使用高數(shù)值孔徑的物鏡。好的物鏡在500nm波長下有80–90%的透射率，但在900nm波長下只有40%甚至更少。其原因在于，對可見光中具有小于0.5%反射率的抗反射涂層在紅外中的反射率會高得多。這一點特別重要，因為光線必須穿過物鏡兩次。

選擇物鏡時，還需要考慮樣品的平坦度，因為高NA物鏡具有良好的深度分辨率（適合高度平整的樣品），這意味著，具有高低起伏形貌的樣品有時會聚焦在樣品表面上，而有時不會。這種情況下，使用低NA的物鏡可能是有益的。

4.3顯微鏡的通量

顯微鏡的通量與物鏡的通量一樣重要。光必須通過顯微鏡兩次，因此損耗是平方的，具有優(yōu)化通量的光學(xué)組件損耗更低。用二向色或全息分束器將激光束耦合到顯微鏡中，該分束器對于激光激發(fā)波長的反射率應(yīng)該盡可能高，而對于拉曼光的透射率也應(yīng)該高?，F(xiàn)在的涂層技術(shù)，可以獲得具有反射性的二向色濾光器（透過率>95%），對于150rel.cm-1以上的斯托克斯位移拉曼光的透射率約98%。只有在探測到反斯托克斯拉曼光譜時，才需要全息濾光片。

為了有效地抑制瑞利線，應(yīng)該使用一個邊緣或槽口濾波器，它可以將激光線強度降低6個數(shù)量級，同時對斯托克斯偏移的拉曼線有一個>95%的通過率。

4.4顯微鏡和光譜儀之間的耦合

顯微鏡和光譜儀之間的光學(xué)耦合極其重要，必須將顯微鏡發(fā)出的光有效地耦合到光譜儀中。如果用平均反射率為85%的金屬鏡，經(jīng)過4面鏡子之后，信號就損失了50%。

此外，光必須耦合到分光計的入射狹縫中，并且其孔徑必須轉(zhuǎn)換成分光計的入射孔徑。比分光計接收角更大的發(fā)散度將導(dǎo)致巨大的信號損失，更小的發(fā)散度將導(dǎo)致分辨率降低，因為光柵僅被部分照射。

如何達到有效的共焦？共焦針孔的尺寸須根據(jù)物鏡像的點擴散函數(shù)直徑來選擇。例如，在633 nm激發(fā)波長下，NA = 0.9的X100物鏡，會在像平面中產(chǎn)生43μm的衍射受限艾里斑。此時，50μm的共焦針孔直徑是理想選擇（最大深度分辨率和高收集效率）。

為了避免信號損傷，通常選擇一根芯徑為50微米的多模光纖。該光纖可作為：

1.一個針孔，因為只有核心部分可以引導(dǎo)和傳輸光。

2.一個效率極高的導(dǎo)光板（如果使用無涂層的入口和出口表面，唯一的損失是4%的入口和出口損失）。

3.作為光譜儀的入口狹縫和作為一個光圈匹配裝置。光纖的出口光圈（NA=0.12）與光譜儀的光圈完全匹配。

目前，大多數(shù)市售光譜儀的通量（包括光柵）只有30-35%（@532 nm），盡管光柵的效率高達80%。這意味著超過50%的光在光譜儀鏡面的涂層中損失了，其原因是大多數(shù)光譜儀沒有針對拉曼信號的小頻率范圍進行優(yōu)化（優(yōu)化可以提高一倍）。

4.5光柵

光譜儀中的光柵通過將每個波長以略微不同的角度偏轉(zhuǎn)，將信號分散到CCD探測器上。高數(shù)量的溝槽/毫米（線/毫米）會導(dǎo)致高分散性和高分辨率，但也將信號分布在大量的CCD像素上。對于典型的樣品，用于共焦拉曼顯微鏡的最窄線的寬度（FWHM=半最大值全寬）不低于2-3cm-1。因此，分辨率約為1cm-1的光譜儀是折衷選擇。

有多個光柵可以切換是非常有用的，這樣就可以使用一個與探測器尺寸匹配的光柵，以確保探測器覆蓋全部拉曼光譜（100至3600rel.cm-1），以及提供約1cm-1分辨率的高分辨率光柵。

為了優(yōu)化效率，光柵通常是針對某一波長，這意味著溝槽是有角度的，這樣光柵的效率在第一衍射階數(shù)上可以達到80%。光柵效率設(shè)定了光譜儀的通量的上限。圖中顯示了一個600線/毫米的光柵效率，波長為500nm。

可以看出，光柵效率在某一波長處達到峰值，并在較短的波長處顯示出強烈的下降。在較長的波長下，下降幅度較小，但如果該光柵在785nm的激發(fā)下使用，其效率會降低2-3倍。

圖2典型的絕對反射效率，對于600線/毫米光柵的500nm的非偏振光的一階反射

4.6 電荷耦合器件（CCD）探測器

CCD探測器是拉曼顯微鏡的關(guān)鍵部件，其對儀器的性能影響很大。CCD相機有各種各樣的探測器尺寸，非冷卻或帶珀爾帖或液氮（LN）冷卻，正面或背面照明，作為深耗損模型或帶紫外線涂層，這只是數(shù)百種變化中的幾個。

CCD探測器由一個光敏硅-光電二極管陣列組成，每個都與一個電容器相連。在光電二極管中，每一個探測到的光子都會產(chǎn)生一個電子-空穴對，這些空穴對被內(nèi)部電場分離，電子被儲存在電容器中。分光探測器的典型探測器尺寸是1024X127像素，像素尺寸為26微米X26微米。

探測器的第一個重要特征是其量子效率（QE）。QE是指探測到的光子占總?cè)肷涔庾拥陌俜直?。由于CCD的感光區(qū)被電氣互連線部分阻擋，典型的CCD（正面照明）探測器的QE在500nm時約為45%。為了提高探測效率，背照式CCD設(shè)備被開發(fā)出來，這意味著它們被蝕刻到約17微米的厚度，光線從背面進入。通過這種技術(shù)和適當(dāng)?shù)姆婪瓷洌ˋR）涂層，可達到90%以上的QE（@500nm）。

典型的正面和背面發(fā)光的探測器的QE曲線的比較見圖3。

圖3背照式（黑色）、背照式深耗損（紅色）和前照式（藍色）CCD探測器的典型QE曲線與波長的關(guān)系

QE決定了拉曼實驗中探測到的信號。但信號中的噪聲或探測器本身產(chǎn)生的噪聲同樣重要。因為信噪比（S/N）決定了測量的質(zhì)量。理想情況下，噪聲應(yīng)該由信號本身的射出噪聲所主導(dǎo)。其他每一個噪聲源應(yīng)盡可能小。

熱噪聲是由探測器本身的熱激發(fā)載流子產(chǎn)生的，可以通過冷卻探測器（珀爾帖冷卻器）來大大減少。在60℃時，對于背照式CCD來說，由熱激發(fā)電子引起的典型背景信號為0.01電子/像素/秒。因此，如果探測器保持在60℃或更低的溫度，熱噪聲（即熱產(chǎn)生的電子數(shù)的平方根）可以在幾分鐘的積分時間內(nèi)被消除掉。熱噪聲通常不是一個限制性因素。

更重要的是探測器本身的讀出放大器的讀出噪聲。讀出噪聲以電子表示，取決于讀出放大器的質(zhì)量以及讀出速度。對于較長的積分時間(>50毫秒），一個慢速讀出放大器就足夠了。一個高端的33kHz讀出放大器產(chǎn)生的噪聲小于4個電子。在100kHz的讀出速度下，最好的相機的讀出噪聲在10個電子左右，而在2.5MHz的讀出速度下，它可以很容易地達到35個電子。

使用一個1024x127像素的探測器和一個33kHz的讀出放大器，最小的積分時間將是大約32毫秒（31個光譜/秒）。一個由256條線組成的圖像，每條線有256個光譜（65635個光譜），用這個積分時間獲得的圖像將需要大約2100秒=35分鐘的采集時間。

如果使用100kHz的讀出放大器，最小積分時間從32秒減少到大約12毫秒（83個光譜/秒），可以在13分鐘內(nèi)獲得圖像，但此時的讀出噪聲等于100電子/像素。

如使用2.5MHz的讀出放大器，積分時間可減少到1毫秒（1000個光譜/秒），采集時間可以低至1分鐘，但可用的信號減少了32倍，讀出噪聲急劇增加。

在非常短的積分時間（快速掃描），讀出噪聲開始支配所有其他的噪聲源。

理想情況下，人們希望有一個具有100% QE的探測器，沒有熱噪聲，沒有讀出噪聲或任何其他噪聲源。這種理想的探測器將總是被射出噪聲限制，這是在物理學(xué)允許的范圍內(nèi)最好的。如果使用長積分時間，具有良好冷卻效果的背照式CCD就非常接近于這種理想的探測器。

最近CCD技術(shù)的發(fā)展導(dǎo)致了一種更接近理想探測器的探測器（至少在一定的波長范圍內(nèi)是如此），這種探測器被稱為EMCCD（(electron multiplying CCD，電子倍增CCD）。

4.7電子倍增CCD——EMCCD

EMCCD是一個普通的CCD，帶有一個額外的讀出寄存器，其驅(qū)動的時鐘電壓比普通的CCD讀出寄存器高得多。由于這個高的時鐘電壓，通過沖擊電離實現(xiàn)了電子倍增，信號的總放大倍數(shù)可到1000倍。

當(dāng)載流子在讀出寄存器中從一個像素轉(zhuǎn)移到另一個像素時，產(chǎn)生多余載流子的概率極低（最大1.0043），但由于這個過程要重復(fù)1600次，總放大倍數(shù)可以高達1.00431600=1000。這樣，總是可以把信號放大到讀出噪聲以上，這樣信噪比總是受到信號的泊松噪聲的限制，即使使用非常快的讀出放大器。這時的信號被稱為射出噪聲限制。

舉個例子，一個1600 x200像素的EMCCD，使用2.5MHz的讀出放大器，可以在1.3ms內(nèi)讀出（760光譜/s），而不會像普通CCD那樣受到讀出噪聲的限制。

如果將讀出限制在CCD芯片的幾條線上，甚至有可能超過1300個光譜/秒。

如果信號不受讀出噪聲的支配（大信號，長積分時間），就可以使用"正常"的讀出寄存器，EMCCD的行為就像最先進的背照式CCD。

盡管EMCCD相機非常敏感，能夠檢測單光子，但它不能被用作單光子檢測裝置，因為它缺乏一個鑒別器。EMCCD與標(biāo)準(zhǔn)CCD相比，可提高信噪比，特別是對于非常低的信號水平和快速讀出。圖4顯示了EMCCD與傳統(tǒng)CCD相比，在4、10和35電子讀出噪聲（33、100kHz和2.5MHz讀出速度）下計算出的信噪比與信號（每像素光子）的關(guān)系。

圖4背照式EMCCD探測器的信噪比與傳統(tǒng)背照式CCD相機比，不同的讀出噪聲水平（4、10和35電子），慢速（33kHz）、中速（100kHz）和快速（2.5MHz）。箭頭表示，在不同的讀出噪聲水平下，EMCCD的信噪比超過傳統(tǒng)探測器的光子數(shù)量（18、111、1362）。

圖5與傳統(tǒng)的背照式CCD相機相比，背照式EMCCD探測器在不同的讀出噪聲水平（4、10和35電子）下信噪比的提高，這是典型的慢速（33kHz）、中速（100kHz）和快速（2.5MHz）讀出速度與每像素光子的關(guān)系。

4.8EMCCD的實測案例

樣品是一個旋涂在玻璃基底上的超薄聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）薄膜。該層被劃傷，并在樣品的一些區(qū)域去除了PMMA。樣品層的高度由原子力顯微鏡AFM確定為7.1nm。此外，在表面發(fā)現(xiàn)了一個針狀的污染，厚度為4.2nm。這個污染層的來源和材料組成最初并不清楚，但可以通過共焦拉曼測量來確定。

圖6是通過在50x50 μm的掃描范圍內(nèi)獲取200 x200個拉曼光譜，并對PMMA的CH拉伸帶的強度在3000 rel. cm?1左右進行積分得到。激發(fā)功率為20 mW @532 nm，使用100×，NA為0.9的物鏡。

圖6玻璃上7.1nm PMMA層的共焦拉曼圖像在2950 rel. cm?1左右的CH拉伸帶處獲得。a背照射式CCD。b, c EMCCD。比例尺10 μm。d樣品示意圖

圖7拉曼光譜（左圖）。玻璃（藍色）上7.1 nm PMMA層（紅色）和4.2 nm污染層（綠色）的共焦拉曼圖。200x200張光譜，每張光譜7毫秒的積分時間?？偛杉瘯r間：5.4分鐘。（右圖）

從圖7可以看出，玻璃基底有一個小的拉曼帶，其信號是PMMA信號的一半，而在完全相同的區(qū)域有3倍的烷烴信號。很明顯，拉曼系統(tǒng)的共焦性對于研究薄層是至關(guān)重要的。

即使有最好的共焦設(shè)置，信息深度也至少是500nm，這意味著500nm的玻璃對拉曼信號有貢獻。由于拉曼信號與材料的數(shù)量成正比，一個標(biāo)準(zhǔn)的（非焦距）設(shè)置會收集到超過300倍的玻璃信號（170微米的玻璃蓋板厚度），使得對薄涂層的探測成為不可能，即使有更長的積分時間。

5結(jié)論

共焦拉曼成像是一種強大的技術(shù)，在各種科學(xué)領(lǐng)域都有應(yīng)用。共焦性可以抑制不需要的熒光背景以及來自基底的背景，還可以以一定深度分辨率進行深度掃描。由于圖像中存在大量的光譜，每個光譜的積分時間必須保持盡可能短。因此，系統(tǒng)的通量非常關(guān)鍵，高通量光譜有助于獲得高質(zhì)量光譜。

使用EMCCD，即使在極低的信號水平下，光譜也可以保持近乎射出噪聲的限制。相比最好的CCD，EMCCD可以使信噪比提高10倍以上，而對于較大的信號，可以關(guān)閉EMCCD，并保留標(biāo)準(zhǔn)背照式CCD的所有特性。

玻璃基底上7.1nm的PMMA以及4.2nm烴層的分布可以很容易被EMCCD探測和識別，每個光譜的積分時間僅為7毫秒。這使得200X200 (=40,000)個光譜的共焦拉曼圖像的總體采集時間減少到僅為5.4分鐘。在532nm激發(fā)下，使用NA=1.4的油浸物鏡，該共焦圖像的衍射限制空間分辨率為230nm。