圖1 BP-TIDT實(shí)驗(yàn)裝置和雙平面并行檢測(cè)光路示意圖

近日，南京理工大學(xué)電子工程與光電技術(shù)學(xué)院陳錢(qián)、左超教授課題組提出了一種新型高速、高分辨率三維無(wú)標(biāo)記顯微鏡技術(shù)。該工作以“High-Speed High-Resolution Transport of Intensity Diffraction Tomography with Bi-Plane Parallel Detection”為題發(fā)表在國(guó)際頂尖光學(xué)期刊Laser &Photonics Reviews，并當(dāng)選為期刊封面論文。電光學(xué)院博士生周寧和張潤(rùn)南，碩士生徐偉勝為本文共同第一作者，南京理工大學(xué)為第一完成單位和通訊單位。

光學(xué)衍射斷層掃描 (ODT) 是一種新興的三維(3D)顯微鏡技術(shù)，利用透明生物樣本的固有折射率 (RI) 作為自然對(duì)比機(jī)制，實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記成像。它能夠以 3D 形式可視化和定量表征此類(lèi)樣本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)熒光成像方法不同，ODT 無(wú)需外源熒光染料，避免了光毒性和光漂白等潛在問(wèn)題。因此，這種非侵入性、無(wú)標(biāo)記的方法已廣泛應(yīng)用于生物物理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、血液學(xué)、微生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，為研究人員提供了生物醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用的有力工具。

基于非對(duì)稱(chēng)照明的非干涉ODT僅需要利用樣品和照明光束之間的相對(duì)角度變化在不同條件下捕獲2D強(qiáng)度圖像。隨后使用這些圖像重建標(biāo)本的3D RI。當(dāng)照明的數(shù)值孔徑(NA)與物鏡的NA相匹配時(shí)，低頻相位分量可以完全轉(zhuǎn)移到強(qiáng)度圖像中。然而，高NA顯微鏡系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)中通常難以嚴(yán)格滿(mǎn)足匹配的照明條件，導(dǎo)致在提高ODT的空間分辨率時(shí)出現(xiàn)低頻缺失的問(wèn)題。雖然低頻區(qū)域的相位分量可以通過(guò)離焦調(diào)制轉(zhuǎn)移到強(qiáng)度圖像中，但軸向離焦需要在顯微鏡中引入機(jī)械運(yùn)動(dòng)，限制了它們?cè)谏飿颖救缁罴?xì)胞動(dòng)態(tài)成像中的適用性。因此，在無(wú)標(biāo)記非干涉ODT中獲得高時(shí)空分辨率的動(dòng)態(tài)3D RI重建仍然是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。

針對(duì)上述問(wèn)題，陳錢(qián)、左超研究團(tuán)隊(duì)提出了一種新型的高速、高分辨率非干涉ODT方法 (High-Speed High-Resolution Transport of Intensity Diffraction Tomography with Bi-Plane Parallel Detection，簡(jiǎn)稱(chēng)BP-TIDT)，并搭建了相關(guān)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)(圖1)。該技術(shù)將雙平面檢測(cè)方案與強(qiáng)度傳輸衍射斷層掃描相結(jié)合，在不引入機(jī)械位移的情況下補(bǔ)償了低頻下缺失的相位信息，有效地解決了傳統(tǒng)非干涉ODT無(wú)法同時(shí)實(shí)現(xiàn)高時(shí)間和空間分辨率的問(wèn)題。

同時(shí)，為了解決傳統(tǒng)迭代求解方法計(jì)算時(shí)間的消耗，推導(dǎo)了如圖2所示的雙平面?zhèn)鬏敼鈴?qiáng)衍射層析理論模型，通過(guò)一次反卷積直接求解線(xiàn)性問(wèn)題，即可得到樣品的3D RI結(jié)果。為了驗(yàn)證所提出 BP-TIDT 方法的定量 3D RI 重建能力，使用聚苯乙烯微球作為測(cè)試樣品進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并將結(jié)果與純相微球的模擬進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模擬結(jié)果幾乎沒(méi)有差異，表明BP-TIDT技術(shù)不需要額外的軸向機(jī)械位移就可以有效實(shí)現(xiàn)定量RI恢復(fù)，克服了傳統(tǒng)ODT方法在非匹配照明條件下觀察到的重建質(zhì)量下降和RI低估的問(wèn)題。

圖2.從PTF角度闡述光照條件和離焦相位調(diào)制在非干涉ODT中的重要性，并通過(guò)聚苯乙烯微球的仿真和實(shí)驗(yàn)結(jié)果論證BP-TIDT方法的有效性。

圖3展示了BP-TIDT方法與96孔板樣品室兼容性分析，以及高速高分辨率活細(xì)胞成像結(jié)果。高通量/高內(nèi)涵成像在生物醫(yī)學(xué)研究中至關(guān)重要，可提供詳細(xì)的細(xì)胞信息和快速的圖像分析。96 孔板作為高通量/高內(nèi)涵成像中常用的樣品室，設(shè)計(jì)有小孔徑和深壁，以維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境，這會(huì)限制光入射角度。圖3所示的96 孔板允許的最大照明 NA 為 0.66。當(dāng)照明 NA 超過(guò)此值時(shí)，孔壁會(huì)阻擋光束，導(dǎo)致圖像信息丟失。本文提出的 BP-TIDT 方法克服了非干涉 ODT 技術(shù)中固有的匹配照明條件，使高 NA 物鏡(例如 40× 0.95 NA)在高通量/高內(nèi)涵成像中的應(yīng)用成為可能，從而顯著提升成像分辨率。

如圖3(c) 所示，BP-TIDT技術(shù)結(jié)合96孔培養(yǎng)皿用于 COS-7 細(xì)胞的高速、高分辨率 3D RI成像。該圖像顯示了分裂過(guò)程中的 COS-7 細(xì)胞，具有兩個(gè)細(xì)胞核。在細(xì)胞分裂期間，細(xì)胞兩極的胞吞作用很明顯，這是一個(gè)高能量需求的時(shí)期。這個(gè)過(guò)程對(duì)于細(xì)胞的能量和物質(zhì)攝入調(diào)節(jié)至關(guān)重要。此外，作為細(xì)胞的能量來(lái)源，線(xiàn)粒體在低能量需求下采用細(xì)長(zhǎng)的形狀以提高代謝效率，并在細(xì)胞分裂期間變得更短更圓以滿(mǎn)足增加的能量需求。研究結(jié)果表明，所提出的方法對(duì)藥物篩選和分子生物學(xué)研究等應(yīng)用特別有益。該技術(shù)通過(guò)更快的速度和更高的分辨率促進(jìn)對(duì)生物樣本的詳細(xì)體積分析，加速了科學(xué)發(fā)現(xiàn)。

圖3 BP-TIDT方法與96孔板樣品室兼容性分析及成像結(jié)果

上述工作得到了國(guó)家重大儀器專(zhuān)項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金、江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃前沿引領(lǐng)專(zhuān)項(xiàng)、江蘇省青年基金項(xiàng)目、中央高?？蒲袑?zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目以及江蘇省光譜成像與智能感知重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金的支持。

審核編輯 黃宇