傳統(tǒng)的組織病理學(xué)處理組織包括固定、包埋、切片和染色等過(guò)程,會(huì)導(dǎo)致所得圖像變形偽影且某些生物信息缺失,這對(duì)于醫(yī)生對(duì)圖像的觀察和解釋都會(huì)造成影響,并且這個(gè)過(guò)程會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間。

對(duì)于非線性光學(xué)顯微鏡,通過(guò)不同的激發(fā)光能實(shí)現(xiàn)不同的非線性成像過(guò)程,不同的非線性成像過(guò)程是由生物樣品中不同的內(nèi)源性生物分子引起的,這就說(shuō)明不同的激發(fā)光能夠“人工”的標(biāo)記各種內(nèi)源性生物分子,而不需要外源性染色劑或其他熒光劑進(jìn)行“物理”標(biāo)記,并且這些非線性成像過(guò)程都可以在實(shí)現(xiàn)CARS的多模態(tài)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)。

圖1中的三個(gè)系統(tǒng)都是比較常見(jiàn)的CARS顯微鏡系統(tǒng),這些系統(tǒng)存在兩個(gè)問(wèn)題:第一,圖中固體激光器直接出射的激光(“紅色”光束)打到顯微鏡系統(tǒng)里,激光器的光束指向隨時(shí)間和溫度可能會(huì)漂移,指向不穩(wěn)定性容易受到日常變化的影響,直接影響顯微鏡系統(tǒng)的成像,所以需要經(jīng)常對(duì)進(jìn)入顯微鏡的光束進(jìn)行重新對(duì)準(zhǔn)。

圖1c中激光器出射的光束通過(guò)分束器分為兩路,下面那路通過(guò)光子晶體光纖產(chǎn)生超連續(xù)譜(“綠色”光束),此時(shí)激光源的光束漂移只會(huì)影響到激光束與光子晶體光纖的耦合,進(jìn)而影響從光纖中出射的超連續(xù)譜的能量,而不會(huì)直接影響后面的顯微鏡系統(tǒng),但分束后上路的“紅色”光束仍存在上面描述的問(wèn)題。第二,實(shí)現(xiàn)CARS的多模態(tài)系統(tǒng)如何選擇光源是一個(gè)需要考慮的問(wèn)題,多模態(tài)系統(tǒng)通常需要飛秒脈沖來(lái)激發(fā)多光子熒光、諧波生成等過(guò)程,但是飛秒脈沖光譜較寬,用于CARS成像時(shí)遠(yuǎn)大于大多數(shù)分子振動(dòng)特征峰的尺度(10cm-1), 使得CARS的光譜分辨率較低,所以CARS顯微鏡一般使用皮秒激光器作為光源來(lái)獲得較高的光譜分辨率。

圖1 常見(jiàn)的CARS顯微鏡系統(tǒng)

2016年,Haohua Tu等人提出的無(wú)標(biāo)記的多模態(tài)非線性成像系統(tǒng)比較好的解決了上面的兩個(gè)問(wèn)題,具體光路圖如圖2,光源為Yb: KYW激光器(1,041 nm, 220 fs, 80 MHz),使用一種保偏的全正色散的光子晶體光纖產(chǎn)生寬帶單模超連續(xù)譜(780-1320 nm),光子晶體光纖放到激光器的后面、分束器的前面,這樣就能保證分束后的兩條光路都不會(huì)由于激光源的光束漂移而導(dǎo)致這兩條光路的光束指向不穩(wěn)定,進(jìn)而影響后面的顯微鏡系統(tǒng)。

激光源的光束漂移只會(huì)影響到激光束與光子晶體光纖的耦合,為了減小這種影響,又使用反饋控制回路將光子晶體光纖的輸出(輸入)耦合功率保持在480 mW (800 mW)。接著通過(guò)離軸拋物面鏡對(duì)輸出的超連續(xù)譜進(jìn)行準(zhǔn)直,又通過(guò)二向色鏡將光束分離為CARS泵浦光束(780-880 nm)和CARS斯托克斯光束(900-1,320 nm)。斯托克斯光束進(jìn)入商用脈沖整形器中,不僅用于CARS成像,還用于2PAF,SHG,3PAF和THG成像。然后,兩路光束通過(guò)另一個(gè)二向色鏡合束,并通過(guò)消色差物鏡(NA = 1．20)聚焦,消色差物鏡能夠?qū)崿F(xiàn)衍射極限成像。

其中,脈沖整形器可以用于對(duì)脈沖振幅整形,進(jìn)行頻譜選擇,讓不同波長(zhǎng)的光通過(guò),激發(fā)不同的非線性成像。還可以進(jìn)行相位整形,用來(lái)補(bǔ)償相位,獲得變換極限脈沖,來(lái)激發(fā)SHG/THG/3PEF/2PEF;另外,斯托克斯脈沖通過(guò)脈沖整形器還能引入啁啾,通過(guò)電動(dòng)裝置調(diào)節(jié)啁啾后的斯托克斯脈沖與泵浦脈沖之間的光學(xué)延遲,實(shí)現(xiàn)“光譜聚焦”,這種“光譜聚焦”的方式可以提高飛秒CARS的光譜分辨率,最后得到的該系統(tǒng)的光譜分辨率為14 cm-1。

并且使用者能對(duì)整形器的振幅-相位掩模進(jìn)行預(yù)編程,這樣激光脈沖通過(guò)脈沖整形器后就會(huì)發(fā)生不同的改變,對(duì)應(yīng)不同的非線性成像過(guò)程也就是激發(fā)不同的內(nèi)源性物質(zhì)。換一種說(shuō)法就是激光在進(jìn)行激發(fā)時(shí)作為可編程的變量,用脈沖整形器實(shí)現(xiàn)對(duì)激光的預(yù)編程,編程好的不同激光可用來(lái)激發(fā)不同的內(nèi)源性物質(zhì)(表1)。通過(guò)編程進(jìn)一步將脈沖整形器變化脈沖與切換檢測(cè)通道相匹配,就能做到激發(fā)和檢測(cè)的匹配。

這樣,未經(jīng)過(guò)激光和顯微鏡培訓(xùn)的操作員在使用該成像系統(tǒng)時(shí),能夠有選擇地在計(jì)算機(jī)屏幕上查看特定的內(nèi)源性物質(zhì),通過(guò)按下預(yù)編程的按鈕可以立即(可以遠(yuǎn)程進(jìn)行)將當(dāng)前成像物質(zhì)更改為其他物質(zhì),激發(fā)和檢測(cè)過(guò)程無(wú)需進(jìn)行組織染色和激光的重新對(duì)準(zhǔn)。

圖2 無(wú)標(biāo)記的多模態(tài)非線性成像系統(tǒng)

表1 預(yù)編程的激發(fā)/檢測(cè)參

該組使用該系統(tǒng)對(duì)大鼠的乳腺腫瘤進(jìn)行了成像,在不同的非線性圖像及它們的復(fù)合圖像中(圖3、圖4)觀察到了正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的區(qū)別以及乳腺腫瘤生成的多個(gè)特征,與傳統(tǒng)組織病理學(xué)作比較,發(fā)現(xiàn)大部分特征在傳統(tǒng)組織病理學(xué)的圖像中都觀察不到,這也證明了無(wú)標(biāo)記的多模態(tài)非線性成像系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。

圖3 乳腺標(biāo)本的非線性多模態(tài)圖像及其相應(yīng)的FFPE–H&E組織學(xué)圖像

圖4 乳腺標(biāo)本的三模態(tài)圖像中顯示出的局部腫瘤浸潤(rùn)的光學(xué)特征

總之,Haohua Tu等人提出的無(wú)標(biāo)記的多模態(tài)非線性成像系統(tǒng)有多個(gè)優(yōu)勢(shì),他們將光子晶體光纖放到了激光器的后面,避免了激光源的光束漂移直接影響到顯微鏡成像;使用“光譜聚焦”的方式提高了飛秒CARS的光譜分辨率;用脈沖整形器實(shí)現(xiàn)對(duì)激光的預(yù)編程,編程好的不同激光用來(lái)激發(fā)不同的內(nèi)源性物質(zhì),通過(guò)編程進(jìn)一步將脈沖整形器變化脈沖與切換檢測(cè)通道相匹配,方便操作人員的使用。

審核編輯：符乾江