克服光學(xué)衍射極限，觀察到亞細胞尺度的生物結(jié)構(gòu)和變化過程一直是生命科學(xué)研究的目標之一，也是超分辨顯微鏡誕生的目的所在。隨著現(xiàn)代顯微成像技術(shù)的發(fā)展和不斷突破，超分辨顯微成像大家庭也一直在補充新鮮血液。不過，這些形形色色的技術(shù)各自也都存在著不足：譬如前面幾期中我們提到的 PALM/ STORM/DNA-PAINT 等單分子定位技術(shù)都需要長時間的多幀采集，并需要高功率激發(fā)光。這意味著它們在很大程度上不適合對活細胞進行成像。

在超分辨顯微成像專題的最后一期中，我們將為大家介紹一種完全不同的，適合活細胞的超分辨顯微技術(shù)——結(jié)構(gòu)光照明顯微成像（Structure Illumination Microscopy, SIM）。

SIM 的原理

SIM 最早是在2005年由 Mats Gustafsson 開發(fā)并提出的，其基本原理是基于莫爾條紋（Moire pattern）——一種常用于產(chǎn)生光學(xué)錯覺的效應(yīng)。

莫爾條紋：由兩個空間頻率相近的周期性光柵圖形疊加而形成的光學(xué)條紋。當兩條線或兩個物體之間以恒定的角度和頻率發(fā)生干涉，而人眼無法分辨這兩條線或兩個物體時，只能看到干涉的花紋。

這個概念聽起來有點高深，但其實莫爾條紋是一種我們在生活中隨處可見的現(xiàn)象（圖1）。大家可以翻翻看自己穿著條紋襯衫的照片，說不定就能看到莫爾條紋的身影哦。

圖1 生活中的莫爾條紋

從圖2我們可以更加直觀地了解莫爾條紋是如何用于顯示高頻信息的：當兩個小尺寸（高頻）網(wǎng)格疊加覆蓋在最右邊的圖像中時，它們之間發(fā)生干涉后就會顯示一個較大尺寸（低頻）的網(wǎng)格，這個網(wǎng)格會包含兩個較小網(wǎng)格的信息。

圖2 兩個相互成一定角度重疊的細網(wǎng)格相互干涉形成的莫爾條紋。From Wikimedia commons

在實際使用時，通過在照明光路中插入一個結(jié)構(gòu)光的發(fā)生裝置（如光柵，空間光調(diào)制器，或者數(shù)字微鏡陣列DMD等），照明光受到調(diào)制后，形成亮度規(guī)律性變化的圖案，然后經(jīng)物鏡投影在樣品上，調(diào)制光所產(chǎn)生的熒光信號再被相機接收。通過移動和旋轉(zhuǎn)照明圖案使其覆蓋樣本的各個區(qū)域，并將拍攝的多幅圖像用軟件進行組合和重建，就可以得到該樣品的超分辨率圖像了。由于需要組合多個圖像，SIM 的成像過程是需要一定時間的，不過遠比STORM這樣的單分子定位超分辨顯微技術(shù)要快許多。

還有一種速度更快的SIM技術(shù)——iSIM（Instant SIM）。它的前身是多焦點SIM（multifocal SIM，mSIM）。mSIM結(jié)合了共聚焦和結(jié)構(gòu)光照明——不是用線，而是用多個稀疏的光點排列成圖案進行照明（圖2）。這些焦點由微透鏡形成，并與發(fā)射光路徑上的針孔相結(jié)合，達到光學(xué)切片的效果。微透鏡陣列可以對來自每個照明焦點圖像進行2倍的光學(xué)收縮，然后通過振鏡將帶有圖案的激發(fā)光投射到整個樣品上進行成像。Curd 等人在文章詳細說明了構(gòu)建iSIM系統(tǒng)的過程（Curd et al., 2015.）。

iSIM 不同于 mSIM 的地方在于，它可以通過微透鏡陣列和掃描振鏡直接組合多個位置的圖像，不需要通過軟件，從而大大提高了速度，并減少了相機噪聲的影響。與PALM/STORM 等技術(shù)相比，iSIM 的速度能提高100倍。與其它結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)相比，iSIM 對樣品的穿透能力要高上10倍，并且具有比轉(zhuǎn)盤共聚焦更好的光學(xué)切片能力，這樣一來，后期反卷積處理的效果也非常好。

圖3 產(chǎn)生多焦點激發(fā)的會聚微透鏡陣列。激發(fā)樣品后，用與微透鏡陣列匹配的針孔陣列抑制非焦平面的雜散光。借助于第二個微透鏡陣列，每個針孔發(fā)射的熒光可實現(xiàn)2倍收縮。振鏡用于光柵多焦激發(fā)和和收集多焦發(fā)射光，在每次曝光期間產(chǎn)生超分辨率圖像（為清晰起見，本圖僅顯示部分振鏡）。（York et al., 2013）

左：原始圖像。右：左圖的動畫示意。

SIM 的應(yīng)用

SIM 和 iSIM 可以將傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率極限降低一半，更重要的是能夠?qū)罴毎M行超分辨成像。iSIM 能夠以高達 100Hz 的頻率采集圖像，并且具有更好的光學(xué)切片能力。這使得 iSIM 能夠在使用傳統(tǒng)熒光染料的同時，對生物結(jié)構(gòu)內(nèi)部進行3維時間序列的超分辨成像。從而讓研究人員可以突破光學(xué)分辨率極限，觀察細胞和組織內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)的動態(tài)過程。

圖4將 iSIM 與其他活細胞成像技術(shù)（轉(zhuǎn)盤共聚焦，線掃描共聚焦）的分辨率進行了比較。這個樣品的挑戰(zhàn)是線粒體內(nèi)部空隙中沒有 Mcherry 表達，因此只有用 iSIM 才能實現(xiàn)超分辨（圖c中用白色箭頭所示）。

圖4 表達 TFAM-GFP（綠色）和 Tom20-mCherry（紫色）的MRL-TR轉(zhuǎn)化人肺成纖維活體細胞。圖a-c用iSIM拍攝，d-f用轉(zhuǎn)盤共聚焦拍攝，g-i用線掃描共聚焦顯微鏡拍攝。（York et al., 2013）

圖a, d, g所示為3 μm體素的最大強度投影（XY），高倍圖顯示的為白色箭頭指示區(qū)域在對應(yīng)時間點的圖像。

圖b, e, h: a, d, g高倍圖中白色矩形區(qū)域的高倍放大。Scalebars: 0.5μm

圖c, f, i: a, d, g中黃線指示的~270 nm切片的軸向（ZY）視圖。Scalebars: 1μm

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運動和生長非常迅速，新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管的形成和生長發(fā)生在約100ms的時間尺度上，iSIM 能夠非常清楚地捕捉到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生長過程（圖5）。

圖5 iSIM拍攝的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動力學(xué)圖像（100Hz）（Yorket al., 2013）

A：200個時間序列中的第一張圖像，顯示了在MRL-TR轉(zhuǎn)化人肺成纖維細胞內(nèi)GFP-Sec61A標記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Scalebar：10 μm

B：A中白色大矩形區(qū)域的放大圖像。白色箭頭指示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管的生長，藍色指示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管的重塑。Scalebar：5 μm

C：A中白色小矩形的放大圖像，140ms內(nèi)新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管形成過程。Scalebar：200 nm

使用iSIM，York等人還成功地對3日齡斑馬魚紅細胞的結(jié)構(gòu)進行了活體成像（圖6），避免了由于運動導(dǎo)致的圖像模糊。展示出了對活樣品生物結(jié)構(gòu)進行無創(chuàng)成像的能力。

圖6 上：100個2D圖像（2673ms）的最大強度投影。顯示3日齡斑馬魚胚胎腦部血細胞中GFP標記的微管。成像深度：20μm；運動方向：從左到右，清晰的細胞邊界顯示沒有由于運動導(dǎo)致的圖像模糊。Scalebar：10μm

下：上圖中紅色方框在特定時間的圖像。黃色箭頭：同一細胞末端的“尾巴”結(jié)構(gòu)；黃色小箭頭：尾部的微管；紅色箭頭：細胞內(nèi)的微管。Scalebar：2μm。

適合 SIM 的科學(xué)相機

SIM 常用于進行高時間分辨率的活體超分辨成像，高速的 sCMOS相機是它們的最佳搭檔。另一方面，由于曝光時間短，SIM對相機采集信號的能力要求也比較高。

因此，背照式sCMOS相機是一個不錯的選擇，如Prime BSI,Prime BSI express,Prime 95B等。95%量子效率帶來的高靈敏度，再加上低讀出噪聲，可以在提高采集速度的同時保證圖片信噪比。另外，均勻的背景對SIM和iSIM這種靠結(jié)構(gòu)光照明來實現(xiàn)超分辨成像的技術(shù)來說也很重要。

審核編輯 ：李倩