圖1：表達(dá)谷氨酸探針SF-iGluSnFR的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物軸突樹突，使用Kinetix sCMOS相機(jī)拍攝。

背景

基里爾·沃爾林斯基(Kirill Volynski)教授領(lǐng)導(dǎo)的沃爾林斯基實驗室，主要致力于研究神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)控機(jī)制，這是大腦中神經(jīng)元之間通訊的基礎(chǔ)。

正如沃爾林斯基教授所解釋的：“神經(jīng)元之間的突觸是健康和疾病中調(diào)制和可塑性的關(guān)鍵位點。因此，詳細(xì)了解在單個突觸水平上調(diào)控突觸傳遞的細(xì)胞機(jī)制，是理解復(fù)雜神經(jīng)元回路運作的先決條件。”

“我們最近開發(fā)了新的成像方法，首次使我們能夠研究Ca2+內(nèi)流與囊泡胞吐之間的關(guān)系，并探測單個小型突觸前末梢的離子通道功能。這些方法基于使用熒光顯微鏡來成像Ca2+離子濃度和囊泡釋放速率的快速變化;以及使用超分辨率掃描離子電導(dǎo)顯微鏡對小突觸前末梢進(jìn)行膜片鉗記錄?！?/p>

“利用這些方法，我們研究介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流進(jìn)入末梢的不同通道如何控制囊泡的釋放，它們?nèi)绾斡绊懲挥|可塑性，以及突觸如何受到其他作用于突觸前末梢的調(diào)制性神經(jīng)遞質(zhì)的影響?！?/p>

挑戰(zhàn)

高速Ca2?成像需要兼具高靈敏度與高速度。此前，Volynski教授的實驗室使用Prime 95B 25mm相機(jī)，在最大化靈敏度和視野的同時實現(xiàn)了高速采集。該相機(jī)在速度、視野(FOV)和穩(wěn)定性方面相比早期的EMCCD方案均有顯著提升。然而，其速度仍是一個限制因素，既難以跟上樣品中的高速動態(tài)變化，也受限于光采集過程——因為必須使用“偽全局快門”觸發(fā)器來控制光源。

在Prime 95B這類卷簾快門相機(jī)中，一幀圖像的采集從傳感器頂部開始，并極快地向下掃描到底部。盡管傳感器頂部和底部之間的時間差非常微小，但它仍可能為高度精密的高速實驗引入畸變。因此，必須使用“偽全局快門”來一次性捕獲整個傳感器。其工作原理是：通過高級硬件觸發(fā)，僅在相機(jī)傳感器所有行都處于采集狀態(tài)時才開始一幀圖像的采集，然后在下一幀之前保持非激活狀態(tài)。圖2中的時序圖概述了這一概念。

圖2：滾動快門相機(jī)的工作時序，以及通過光源觸發(fā)實現(xiàn)全局曝光。

相機(jī)在開始曝光前必須等待的時間被稱為“死區(qū)時間”或“幀時間”，它直接由相機(jī)的幀率決定。相機(jī)速度越快，能夠獲取的全局?jǐn)?shù)據(jù)就越多。

Kinetix相機(jī)具有低噪聲和高速讀出特性，這使我們能夠在更高幀率下成像的同時捕獲更多光子?！餇枴の至炙够淌?/p>

解決方案

Kinetix是一款革命性的sCMOS相機(jī)，其量子效率與Prime 95B一樣接近完美的95%，同時憑借其“靈敏度”模式下更低的讀出噪聲，能夠更準(zhǔn)確地測量信號。此外，它在幀率和傳感器尺寸方面均有提升。Kinetix是一款1000萬像素的相機(jī)，擁有巨大的29.4毫米對角線傳感器——在其“靈敏度”模式下，整個視場可以以每秒88幀的速度讀出;而Kinetix還具備“速度”模式，在該模式下，整個1000萬像素傳感器可以驚人的每秒500幀的速度讀出。

Kinetix的“靈敏度”和“速度”模式將為偽全局快門成像帶來哪些改進(jìn)?

靈敏度模式：更長的曝光時間

對Volynski教授來說，延長有效曝光時間(即“幀時間”加上“觸發(fā)開啟”時間)至關(guān)重要。Kinetix的幀時間比Prime 95B快得多，那么，如果我們比較Kinetix在靈敏度模式下與Prime 95B的相似200行感興趣區(qū)域(ROI)，這是否會導(dǎo)致更長的有效曝光時間?

在200行ROI下，兩臺相機(jī)的速度均為300fps，即每幀3.3毫秒。區(qū)別在于幀時間：Prime 95B為2.08毫秒，留給光源開啟和光子收集的時間為1.25毫秒;而Kinetix在靈敏度模式下為0.71毫秒，留給光源開啟的時間為2.6毫秒，是Prime 95B的兩倍多。因此，在相同幀率下，Kinetix更短的幀時間實現(xiàn)了更長的有效曝光，如圖3所示。

圖3：Prime 95B與Kinetix(靈敏度模式)的偽全局快門時序示意圖。兩臺相機(jī)在200行ROI下均以300fps運行。由于Kinetix的幀時間更短，其“靈敏度”模式能實現(xiàn)顯著更長的“觸發(fā)開啟”時間，從而收集更多光子。

速度模式：更長的曝光時間與更高速度

除了更長的有效曝光時間，Volynski教授還追求高速度以捕捉動態(tài)鈣活動。這正是Kinetix速度模式的用武之地，它能以500幀/秒的全傳感器速度運行，從而捕捉超快速特征。

以前述相同示例為例，當(dāng)Kinetix處于速度模式時，其幀時間極短(0.13毫秒)，因此有足夠時間完成200行掃描，最終實現(xiàn)600幀/秒的整體幀率。即使采集速度提升了一倍，其觸發(fā)時間仍比Prime 95B的1.54毫秒長20%，從而實現(xiàn)了更高的速度與更長的照明時間，如圖4所示。

圖4：Prime 95B與Kinetix(速度模式)的偽全局快門時序圖。目標(biāo)與之前相同，均為300幀/秒和200行感興趣區(qū)域。在速度模式下，Kinetix的幀時間快得多，因此能在相同時間內(nèi)采集到兩倍的幀數(shù)，同時還能保持每幀多20%的“觸發(fā)開啟”時間用于光線收集。

Kinetix是一款突破性的相機(jī)，將速度與靈敏度完美結(jié)合，在大尺寸傳感器上實現(xiàn)了超高速與超低噪聲。它不僅性能強(qiáng)大，還具備極高的靈活性，可通過先進(jìn)的硬件觸發(fā)和讀出模式(如偽全局快門)對讀出進(jìn)行精細(xì)控制。

與上一代CMOS相機(jī)相比，Kinetix的速度提升，在其“靈敏度”模式下，可為偽全局快門應(yīng)用帶來有效曝光時間的顯著增加，從而收集更多光線。而其“速度”模式擁有極快的幀時間，既能提升速度，又能增加有效曝光時間。

此外，Kinetix的傳感器寬度更大，還能提供比前代產(chǎn)品寬18%的水平視場。

審核編輯 黃宇